一种简单易行的重组方法—三引物PCR法-论文
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简手厦 第４７卷第１６期２００２年８，Ｅｌ错学 担 一
种简单易行的重组方法一一三引物ＰＣＲ法
邓朝阳 宋贵生 徐军望 朱祯
（中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京１００１０１． 同等贡献．十联系人，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｚｈｕ＠
ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ａｃ．ｃｎ）
摘要 报道了一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组ＤＮＡ方法一
一三引物ＰＣＲ法（ＴＰ．ＰＣＲ）．
ＴＰ．ＰＣＲ反应体系中有２种模板和３种引物，从而在同一个
反应体系中产生一个重组ＤＮＡ分子．这种
方法的主要优点是快速、高效且不依赖连接片段的限制酶位
点．用这种方法已成功构建了融合蛋白基
因—— 基因．
关键词ＤＮＡ重组ＴＰ．ＰＣＲ
豇豆蛋白酶抑制剂
ＤＮＡ的体外重组一般是通过在准确的限制酶位
１材料与方法
（ｉ）模板和引物．在ＴＰ．ＰＣＲ的同一个反应体
系中有２种模板和３种引物．２种模板是质粒ｐＢ
ｌｕｅＬ３
和ｐＳＫＴＩ，分别带有ｃｐｔｉ基因 和ｓｋｔｉ基因 引，ｓｋｔｉ基
点对
两个ＤＮＡ片段连接进行的．一般来说，标准的
ＤＮＡ重组方法需要对所连接的ＤＮＡ片段的限制酶
位点有所了解【ｌ】，然后用限制性内切酶消化，这时带
有黏性末端或平末端的ＤＮＡ片段可
以通过ＤＮＡ连
接酶连接在一起形成重组的ＤＮＡ分子．然而，在一
因提供信号肽编码序列
．３种引物是Ｆ引物（５ ．
ＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣ．３，），Ｒ引物（５
一ＴＣＴ－
ＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴ＿３ ）和
些重组反应中，没有合适的限制酶切位点可以利用．
目前已有一些方法被用来解决这个困难，如通过
定
点突变来产生新的限制酶切位点【２ 或通过接头来对
目的片段进行准确的扩增 】．然
而，这些方法或很昂
贵或需要额外的遗传操作，从而使其应用受到很大
的限制．本研究采用
一种新的方法一一三引物ＰＣＲ
Ｉ引物．其中Ｆ引物和ｓｋｔｉ基因的５ 末端互补；Ｒ引物
和ｃｐｔｉ基因的３ 末端互补并带有Ｌｖｓ—Ａｓｐ—Ｇｌｕ—
Ｌｅｕ（ＫＤＥＬ）内质网延迟信
号序列和一终止密码子 ；
中间引物（Ｉ引物）长为５５个碱基，其５ 端（１～２５）和
ＳＫＴＩ信号肽编码序列互补，３ 端（２６～５５）和ｃｐｔｉ基因
的５ 末端互补．
法
（ＴＰ．ＰＣＲ）进行ＤＮＡ重组．此方法仅需在同一个
ＰＣＲ反应体系中加入２种模板和３种引物即
可产生
重组的ＤＮＡ分子．
ｃｐｔｉ基因是丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的成
（
ｉｉ）三引物ＰＣＲ原理． 如图１所示，第１个循
环，Ｉ引物以质粒ｐＢｌｕｅＬ３上的ｃｐｔｉ基
因序列为模板
合成ｃｐｔｉ基因的正义链．第２个循环，Ｒ引物合成ｃｐｔｉ
基因的反义链
，此时的ｃｐｔｉ基因的５ 端和３ 端分别带
员之一，由于其产物的广谱抗虫能力，在植物基因工
程上已被广泛用作抗虫基因【４】．然而，ＣｐＴＩ蛋白是一
种细胞质蛋白，在代谢活跃的叶
细胞环境中会不断
地被降解，外源ＣｐＴＩ蛋白在转基因植物的叶子中积
累水平很低【５
】．本研究中，融合基因ｓｃｋ编码的融合
有额外的核苷酸序列．ｃｐｔｉ序列中额外的３ 端序列和
ＳＫＴＩ信号肽编码序列互补并在下一个循环中作为引
物．在第３个循环中，ＳＫＴＩ信号
肽编码序列得到延伸
并被加在反义链上，产生了反义链３ ．信号肽序列．
ｃｐｔｉ基因．
ＫＤＥＬ．５ ．在第４个循环中，Ｆ引物以反义链
３ ．信号肽序列．ｃｐｔｉ基因．ＫＤＥＬ．５
为模板产生正义链
在其后的循环中，富余的Ｆ引物和Ｒ引物即可大量地
合成融合蛋白基因
目的片段ｓｃｋ．ｓｃｋ是编码融合蛋白
的各种序列名称首字母的缩写（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄ
ｅ—ｃｐｔｉ—
ＫＤＥＬ）．
蛋白由３部分组成：融合蛋白Ｎ末端的信号肽、中间
的ＣｐＴＩ肽以及Ｃ末端的内质网延迟信号肽１ 引．信号
肽可以指导胞质中合成的多肽进入内质网
（ＥＲ），然
而ＥＲ延迟信号肽可以使蛋白滞留在ＥＲ中．通过这
种方法，转基因植物中外
源的ＣｐＴＩ蛋白可被导入并
滞留在ＥＲ～个代谢相对不活跃的环境中．由于
在转基因植物
中蛋白质定位方式的变化，其积累水
平也得到了很大的提高．
ｗｗｗ．ｓｃｉｃｈｉｎａ．
ｃｏｍ
在１００ ｕＬ的ＰＣＲ反应体系中，含质粒ｐＢｌｕｅＬ３
１２４７
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钭 苏 第４７卷第１６期２００２年８月
２ ３ ４
简｝暖
ｂｐ
＿＿＿－＿＿－■ｈ＿＿・＿＿・＿＿・＿＿＿＿＿
ｌ第 １次循
。’。。。。。。。。・・。－・—卜ｌ＿＿・＿＿．
１第２次循环
［< br>÷Ｈ＿—● －・
二：二 二二
ｌ第３次循环
…・－－＿・＿＿・－＿＿－ －・－１．
●１第４次循环
－
’ ——》 ＊
４１５
３６ ５
＿
一
…
…
＿
－
ｌ
一
＿
－
＿
・
＿
・
－
－
・
・
＿
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－
－
・
－
－＿●－－－－＿ ●
－－－－
共３６－Ｎ￣
Ｖ
ＳＫＴＩ信号肽编码区 ＣｐＴＩ编码区 ＫＤＥＬ区
图２ Ｔ Ｐ—ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳分析
修饰的ｃｐｔｉ
●＿ ＿＿＿－－’◆ ■■＿－＿ ＿ ■
１示审１７４１Ｈａｅ１１Ｉ Ｍａｒｋｅｒ；２示Ｆ引物和Ｒ引物扩增产物，３示Ｉ引物和Ｒ
ＫＤＥＬ ３ 端引物（ｃｐｔｉ） 引物扩增产物，４示ＴＰ．ＰＣＲ扩增产物 ５ 引物【ｓｋｔ ｉ） 中间引物
图１三引物ＰＣＲ原理示意图
３讨论
设计合理的中间引物是保证 ＴＰ—ＰＣＲ反应成功
的关键．只有中间引物设计合理才能保证两种ＤＮＡ
片段在融合位点 正确连接．３条引物的浓度比例是另
一
和ｐＳＫＴＩ各１００ ｎｇ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，Ｆ引物和Ｒ引
物各０．２￣ｍｏｌ／Ｌ，中间引物０．００２～０．０２￣ｍｏｌ／Ｌ，１ ０
ＪａＬ ＰＣＲ反应缓冲液（１０ｘ）．９８℃预变性１０ ｍｉｎ后加入
２ Ｕ Ｖｅ ｎｔ ＤＮＡ聚合酶，并覆盖上一层石蜡油，９５℃变
性４０ Ｓ，５８℃退火４０ Ｓ，７２℃延伸 １ ｍｉｎ，３６个循环后
７２℃延伸５ ｍｉｎ．
个关键因素，要适当调节中间引物的比 例使得ＴＰ—
ＰＣＲ反应获得最理想的结果．实验结果表明，合适的
比例范围可有效增加目 的片段的扩增，同时减少非
特异产物的扩增，一般来说在１／１０００～１／１００范围内
２结果
ＰＣＲ产物在２％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测
（图２），结果发现，用Ｉ引物和Ｒ 引物的ＰＣＲ反应中，
得到了一条３６５碱基的扩增片段，其长度和预期的一
致．然而，在 ＴＰ—ＰＣＲ扩增中经常会出现两条扩增条
带（图２，第４泳道）．较亮的条带（４１５ ｂｐ）比第 ３泳道
（３６５ ｂｐ）中扩增条带略长，这条亮带即为融合蛋白目
的基因片段ｓｃｋ．然 而，用Ｆ和Ｒ引物的ＰＣＲ反应中，
比较合适．除此以外，为了保证ＰＣＲ产物的高忠实
性 ，需用高忠实的ＤＮＡ聚合酶来代替Ｔａｑ聚合酶．
ＴＰ—ＰＣＲ法的主要优点在于它的简单易行．因 为
我们可以在所期望的任何位点将两种ＤＮＡ片段连接
起来，而不需知道ＤＮＡ片段的限制 位点．由Ｈｏｒｔｏｎ
等人… 所发展的重组ＰＣＲ系统可以用４种引物和２
种模板来产生 重组ＤＮＡ分子，然而这种方法的缺点
是需要在不同的ＰＣＲ管中进行两轮ＰＣＲ反应，这将
会增加污染的概率．通过ＴＰ—ＰＣＲ进行重组操作，可
没有产生任何条带．较亮的条带用Ｋｌｅｎ ｏｗ酶补平后
纯化回收，插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋｓ（＋）的ＥｃｏＲＶ位点 刚，
得到克隆质粒ｐＢｌｕｅＳＣＫ．测序结果证实，所获融合
蛋白基因长４１５ ｂｐ，和预期完全一 致（图３）．这样通
过ＴＰ—ＰＣＲ方法，我们成功地获得了融合蛋白ｓｃｋ基因．
１２４ ８
以在几个小时内于一个ＰＣＲ反应体系中完成．原则
上，这种方法还可以用来产生两种Ｄ ＮＡ片段的完整
分子．如果中间引物设计合理的话，甚至可以将几种
ｗｗｗ．ｓｃｉｃｈｉ ｎａ．ｃｏｍ
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简丰辰
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ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＡＴ
Ｃ ＴＴＣ
ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＴＣ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＣＣ
ＡＣＣ ５４
Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ １７
ＴＣＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＣＣ
Ｔ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ＧＣＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ
ＣＴＧ ＧＴＡ １０８
Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ ＡｌａｔＡｓ
ｐ Ｐｈｅ ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ ３５
５５ １８
１０９
３６
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ＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＡＡＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＧＧＡ ＡＧＴ １６２
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌ
ｅｕ Ａｓｎ Ｈｉ８ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ５３
１６３
ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ
ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＣＣ
Ａ ＴＧＣ ＴＧＣ ２１６
５４
Ａｓｎ Ｈｉ８ Ｈｉ８ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｃｙｓ ７１
２１７
ＧＡＴ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＴＡ ＣＣ
Ｔ ＣＣＴ ＣＡＡ ＴＧＣ ＣＡＴ ＴＧＴ ＡＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ２７０
７２
Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｃｙｓ
Ｈｉ８ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ ８９
２５３ ＡＧＧ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＴＧ
Ｔ ＣＡＣ ＴＣＧ ＧＣＴ ＴＧＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＣＡ ＣＧＡ ＴＣＡ
ＡＴＧ ３２４
８４
Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｈｉ８ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｍｅｔ １０７
３
２５
ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＧＣ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＧＡＴ
ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＡＣ ＡＡＡ ＣＣＴ ＴＧＣ ＡＡＧ ３７８
１０８
Ｐｒｏ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ １２５
３７９
ＴＣＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＡＡ Ｇ
ＡＴ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＴＣ ＴＡＧ Ａ
１２６ Ｓｅｒ
Ａ
ｒｇ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
５ ６
４１５
１３６
７ ８ ９
图３ ｓｃｋ基因的碱基序列和推测的氨基酸序列
融合蛋白编码序Ｙ￣］（ｓｃｋ基因）通过三引物ＰｅＲ法扩增得到，长为４１５ ｂｐ，其中包括编码
ｌ３６个氨基酸的４Ｉ１个碱基和一个终止密码子．融合蛋白由Ｎ端
２５个氨基酸的信号肽（来自ＳＫ
ＴＩ）、１０７个氨基酸的ＣｐＴＩ多肽以及Ｃ端的ＫＤＥＬ信号组成，其中ＣｐＴＩ多肽Ｎ端的两个甲硫氨酸由
精氨酸和苯丙氨酸
取代从而产生一个信号肽加工位点．箭头示预测的信号肽加工位点，下画线序列分别
示ｓｋｔｉ基因的５ 末端引物、中间引物和带有ＫＤＥＬ和终止密码子
的ｃｐｔｉ ３ 端引物 <
br>ＤＮＡ片段连接起来．
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎ
ｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ
１９８９．１０：２０—２４
本研究中所产生的ｓｃｋ融合基因已被用来构建成
玉米泛素蛋白基因启动子控制下的植物表
达载体【１ ．
Ｈｉｌｄｅｒ Ｖ Ａ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ Ｎａｔｕｒｅ，１ ９
８７，３００：１ ６０—１ ６４
Ｗａｎｄｅｌｔ Ｃ Ｉ，Ｋｈａｎ Ｍ Ｒ Ｉ，Ｃｒａｉｇ
Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｖｉｃｉｌｉｎ ｗｉｔｈ ｃａｒ—
转基因水稻的蛋白酶抑制活性检测证实，ｓｃ
ｋ转基因
水稻的蛋白酶抑制活性是ｃｐｔｉ转基因水稻的２倍，一
些个体甚至达到了４倍．
生物活性检测和大田试验表
明，ｓｃｋ转基因水稻对鳞翅目等的害虫表现出很强的
抗性．
致谢 本工作为国家高技术研究发展计划（批准号：
２００１ＡＡ２１２０４１，２００１Ａ
Ａ２２２２５１）、国家自然科学基金（批准
号：３９９８９００１）和国家转基因植物研究与产业化
开发专项
（批准号：Ｊ９９一Ｂ一００４，Ｊ９９一Ａ一０２０）资助项目．
ｂｏｘｙ－ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ ＫＤＥＬ ｉｓ ｒｅｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕ
ｌｕｍ ａｎｄ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｔｏ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖ
ｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ
Ｊ，１９９２，２（２）：１ ８１
—１９２
Ｈａｍｍｏｎｄ Ｒ ｗ．Ｆｏａｒｄ Ｄ Ｅ．Ｌａｒｋｉｎｓ Ｂ Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｂｏｗｍａｎ—Ｂｉｒｋ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ．Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１ ９８４，２５９：９８８３—９８９０
Ｐｅｌｈａｍ Ｈ Ｒ Ｂ．Ｔｈ
ｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｆｏｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，１９９０，１５：
４８３～４８６
Ｓｏｎｇ Ｓ Ｉ，Ｋｉｍ Ｃ Ｈ，Ｂａｅｋ Ｓ Ｊ．ｅｔ ａ１．Ｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
参
１
考 文 献
ｃＤＮＡｓ
ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｆｏｒ ｓｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ｔｒ
ｙｐ—
ｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｋｕｎｉｔｚ ｔｙｐｅ）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１９９３
．１０１：１４０１—１４０２
Ｎｅｌｓｏｎ Ｍ Ｒ，Ｃｒｅｕｔｚ Ｃ Ｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ Ｔ，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ Ｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ－
ｒａ
ｔｏｒｙ Ａｎｎｕａ１．２ｎｄ ｅｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８
９
Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ Ｍ，Ｈｕｎｔ Ｈ Ｄ，Ｈｏ Ｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｈｙｂｒｉｄ ｇｅｎｅｓ
２ Ｂｏｙｌａｎ Ｍ Ｏ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｊ，Ｄｈｅｐａｇｎ
ｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏ
ｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ：Ｇｅｎｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ
ｆｕｓｅｄ ＬｕｘＡＢ ｇｅｎｅ ｂｙ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｂ
ｉｏｌｕｍｉｎ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅ．１９８９．７７：６１—６８
Ｃｈｅｍｉ
ｌｕｍｉｎ，１９８９，４：３１０—３１６
３ Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ，Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ａ ｐｏ－
ｌｙｍｅｒ
ａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，
１５５：
３３５—３５０
４ Ｒｙａｎ Ｃ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓ—
ａｎｄ ｍｕｔ
ａｎｔ ｂｏｖｉｎｅ ａｎｎｅｘｉｎ ＩＶ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｆｏ
ｕｒ ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ
Ｐｕｒｉｆ．１９９５．６：１３２～１４０
Ｔａｋｉｍｏｔｏ Ｉ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ａ
Ｈ，Ｑｕａｉｌ Ｐ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｎ—ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ａ ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍａｉｚｅ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｇｅｎｅ（Ｕｂｉ一
１）
ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９
９４，２６（３）：１００７￣１０１ ２
（２００２—０２－０９收稿，２００２－０６－２５收修
改稿）
１２４９
ｗｗｗ．ｓｃｉｃｈｉｎａ．ｃｏｍ