流式细胞仪Protocol
河北经贸大学学位办-精神文明创建活动方案
第一章 流式细胞仪的结构和原理
第1节 流式细胞术发展史
纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同
科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，
每一步都
是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医
学、分子生物学、有机
化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是
由于结合了单克隆抗体技术、定量细
胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床
医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加
突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋
势可归纳为：① 流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实
际应用的便携式、台式、高
分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②
对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单
色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15
种荧光信号；③ 从检测参数的相
对定量发展为绝对定量；④
从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤
所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为
配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细
胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述
各门学科知识，只有这样才能更好地
将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。
流式细胞术的发展简史：
1930年 Caspersson 和
Thorell 开始致力于细胞的计数；
1934年 Moldaven
是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一
根毛细管的细胞数量；
1936年 Caspersson等引入显微光度术；
1940年 Coons
提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；
1947年 Guclcer
运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器；
1949年 Wallace Coulter
提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利；
1950年
Caspersson用显微分光光度计的方法在紫外线（UV）和可见光光谱区检测细胞：
1953年 Croslannd-
Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器；
1953年
Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；
1954年
Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器；
1959年
B型Coulter计数器问世；
1965年
Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对
细胞分类；
1967年
Kamemtsky和
Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法；
1969年 Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los
Alamos，NM(即现在的National Flow
Cytometry Resource
Labs),发明第一台荧光检测细胞计；
1972年 Herzenberg
研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的
细胞的较弱的荧光信号；
1975年 Kochler和Milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的
免疫试剂
的应用奠定了基础。
从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细
胞术进入了一个空前飞
速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料
的开发、
细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入21
世纪，流式细胞术作为一门生
1
物检测技术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。
第2节 流式细胞仪结构和工作原理
流式细胞仪（Flow
cytometry ,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、
电子计算机以及细
胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，
流式细胞术就是对于处在快速直
线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分
析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器问
世，科技工作者们进行了不懈的努力，随着各
项相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细
胞分析和分选的重要工具。
流式细胞仪分为三大类：
一类为台式机，临床型，其特点为：仪
器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简
便，易学易掌握，见图1-2-1。
图1-2-1
临床型台式流式细胞仪
（左：BD FACSCalibur—2L，4F； 右：Coulter
EPICS XLXL-MCL—1L，4F
中：Partec，cyFlow—1L,3F）
第二类为大型机，科研型，其特点为分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并
可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和
类型的激光
器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，见图1-2-2、1-2-3。
2
图1-2-2 大型科研型流式细胞仪
（左：BD，
FACSDiVa
—14F，four-sorting；
右：Coulter EPICS ALTRA—4L,8F；
中：Partec，CyFlow
SPACE―2L，6F）
第三类为新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪
器选用2-4根激光管，最多检
测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数的同时分析。并且
可以实现高速分选，
速度达到50,000个秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。
图1-2-3
目前最新型流式细胞仪
（左上：partec，CyFlow
ML―FSC,2xSSC,FL1~FL13；右上：Coulter，Cytomics
TM
FC 500
左下：FACSAria，FSC，SSC，FL1-FL13；
右下：BD，BD LSR，4L，10F）
3
（一）
流式细胞仪的结构
FCM的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②
激光光源及光束成形系统；
③ 光学系统；④ 信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤
细胞分选系统。见图1-2-4。
图1-2-4
流式细胞仪的光路结构
1、流动室与液流驱动系统
流动室（Flow Chamber 或
Flow Cell）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流
动室由石英玻璃钢制成，并在石英
玻璃中央开一个孔径为430×180µm的长方形孔，供细胞
单个流过，检测区在该孔的中心，这种流
动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时
间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜
，可获得很高的检测灵敏度和测量精
度。
流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，
鞘液流是一种稳定流动，操作人员
无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦
，使样品流不会脱离
液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细
胞荧光
信息，见图1-2-5。
图1-2-5 FCM的流动室和液流系统
细
胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli方程，
即P=(
12)PV（勿略高度的变化），可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而
可确保每个细胞
流经激光照射区的速度不变。
从图1-2-5可以知道，真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加
在鞘液上，一恒定
的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行
中流
速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样
4
本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间
内流
经光照射区的细胞数就增加。
这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分
布为正态分布（见图1-2-5），
中心处能量最高，因此当样本速率选择高速（Hi）时，处在样品流
不同位置的细胞或颗粒，
受激光光照的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这样就会造成测
量误差。当
在测量分辨率要求高时（如DNA分析）应选取用低速（Low）。
2、激光光源与光束成形系统
目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光（light amplification
by stimulated
emission of radiation , Laser）是一
种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，
是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因
为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的
时间仅为1微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的
荧光信号强弱，与被照射的时间
和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。
激
光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm即短
轴稍大于细胞直
径的光斑（见图1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证
样品中细胞受到的光照
强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，
台式机FCM的光路调节对使用者是
封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作
任何调节，所以使用者操作十分方便。
3、光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的
荧光信
号送入到不同的电子探测器（见图1-2-6）。
在FCM的光学系统中主要光学原件
是滤光片（Filter），主要分成3类：长通滤片
（long-pass filter,
LP）、短通滤片（short-pass filtr, SP）及带通滤片（band-pass
filter, BP）。
（1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通
过。如LP500
滤片，将允许500μm以上的光通过，而500μm以下的光吸收或返回。
（2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或
返回。如SP5
00滤片，将允许500μm以下的光通过，而500μm以上的光吸收或返回。
（3）带通滤片：带
通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，
一个为允许通过波长的中心值，另一
为允许通过光的波段范围。如
BP500表示其允许通过
波长范围为475μm-525μm。
图1-2-6 流式细胞仪的光学系统
5
4、信号检测与分析系统
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照
射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、
不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间
360度立体角发射，产生散射光和荧
光信号。
（1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forward
scatter,FSC）和侧向角散射（side
scatter,SSC），散射光不依赖任何细
胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理
参数或称固有参数（见图1-2-7）。
① 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相
关，通
常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，
以避免对被测细胞
的干扰。
② 侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90
o
方向的散射光信号
，侧向散射光对
细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数
组合，可
区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞
群体，或在未进行裂解
红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。
激光 前向角散射
侧向角散射
图1-2-7 流式细胞仪的散射光图
（2）荧
光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在
激光照射下，发出微弱
荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，
受激发照射得到的荧光信号，通过
对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞
参数的存在与定量(图1-2-8)。
激光
图1-2-8 激光的作用原理
Fl
6
F
r
e
q
荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子
结构不同，其荧光激发谱与发射谱也
各异。选取染料或单抗所标记的荧光素，必须考虑仪器所配置光源的
波长。目前台式机FCM
常配置的激光器波长为488nm，通常可采用的染料有碘化丙锭
(propidium iodide，PI)、藻红
蛋白
(phycoerythrin，PE)、异硫氰酸荧光素（fluorescein
isothiocyanate，FITC）、PE-CY5等。
①
荧光信号的线性测量与对数测量
荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素
的细胞与激光正
交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管<
br>（PMT），PMT将光信号转换成电信号。有些厂家不采用PMT，而采用线性放大光电转换
器
，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降
低，最高速度不
可能超过3 300个细胞秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此
高档仪器不采用此种方法
。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。
线性放大器，即放大器的输出与输入
是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含
量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜
表面抗原等的检测时，通常使用对数放大器，
如果原来输出是1，当输入增大到原来的十倍时，输出为2
；当输入增大到原来的100倍时，
输出为3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几
十倍，甚至几万倍。如
用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。
② 荧光信号的面积和宽度
所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对
DNA含量测量时，采
用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映
DNA的含量，
当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对
荧
光信号积分后，所得到的信号值就相等。
荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联
体细胞，由于DNA样本极易聚集，当两
个G
1
期细胞粘连在一起时，其测量到的DN
A荧光信号（FL2-A）与G
2
M期细胞相等，这
样得到的测量数据G
2<
br>M期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将
双联体细胞排除。其
原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G
2
M细
胞大，因此
设”门”后才能得到真正的DNA含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的
高度峰和面积峰也可做
同样分析。
③ 光谱重叠的校正
当细胞携带两种荧光素（如PE和FITC）受激光激发
而发射出两种不同波长的荧光时，
理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到
另一种荧光。但由于
目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，
但发射
谱范围有一定重叠。要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品
或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。采用双激光立体光路技术，就是为了减少各种
荧光间相互
干扰。其原理是在光路上的光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其
它杂散光信号，从而确保
光源程序间互不干扰。因此可以避免有第1激光（488nm）激发出
的FL1、FL2、FL3和第2
激光（635nm）激发出的FL4间的补偿。当然，FL1、FL2和FL3
是来自同一点光源，它们
之间的补偿是不可避免的。
5、FCM测量数据的存贮、显示和分析
目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队（list
mode）方式。因为目前FCM所采用
的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4个，采用list
mode方式可大量地节约内存和磁
盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000个细胞，
所占容量为4×10000个（字
或双字）。同时当只检测1个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它
3 个参数，节省34的
空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通
常有一维直
7
方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。
（1）单参数直方图：
细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以分布直方图（distribution histogra
m）
来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值。其单位是道数，横坐标
可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数，见图1-2-9。
图1-2-9
DNA含量直方图和抗原表达直方图
左图较低道数处细胞峰为G
1
期细胞
，道数为G
1
期细胞两倍的是G
2
M期细胞，二者之
间是S期细胞。
右图10
0
-10
1
（M1）为阴性细胞，而10
1
以上（
M2）为阳性细胞。
（2）双参数数据的显示
双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两
个参数与细胞数量的关系，常用的表达方
法有二维点图（dot
plot）,等高线图（contour plot）,二维密度图（density plot）。在二维图中
，
X坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中
可以
将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。在左下图为FSC和SSC组成
的点图，从图中
可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可
以分别分析各细胞亚群的统计
数据。右下图是通过设‘门’分析（gating analysis）得到的
FL1和FL2散点图，
设‘门’可以是单参数设‘门’，也可以是双参数设‘门’，通过设”门”
可以调出其它参数的相关信息
，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图1-2-10(左)
就是通过细胞的前向角和侧向角散
射光双参数点阵图，设”门”圈出标本中的淋巴细胞群体，
再调出免疫荧光的散点图图1-2-10（右
）。
散射光图 双色标记荧光图
图1-2-10 双参数免疫荧光点阵图
（二）流式细胞仪的主要技术指标
8
1、荧光测量灵敏度：灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信
号的重要指标，一般以
能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，一般现在FC
M均可达到
600个荧光分子。
2、仪器的分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV（coeffeient
of variation）值来表示：
CV=dm×100%(d-是分布的标准误差，m-是分布的平均值)
如果一群含量完全相
等样本，用FCM来测量，理想的情况下，CV=0，用FCM测量曲
线表示为图1-2-11（左），
但是在整个系统测量中，会带入许多误差，其中样本含量本身的
误差，样本在进入流动室时照射光的微弱
变化，再加上仪器本身的误差等，实际得到的曲线
为图1-2-11（右）。
图1-2-11 仪器分辨率的显示—CV值
CV值越小则曲线分布越窄越集中
，测量误差就越小。一般的FCM在最佳状态时CV
值<2%。CD值的计算，除采用以上计算公式外，
还可以用半高峰宽来计算。半高峰宽指在
峰高一半的地方量得的峰宽，m代表峰顶部的荧光道数；它们与
CV值的的关系式如下：
CV=半高峰宽m×0.4236×100%
上述公式是建立在正
态分布条件下，而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形，
故采用半高峰宽所计算得到的CV值要
明显小于前公式得到的CV值，这在实际工作中应引
起注意。
3、前向角散射光检测灵敏度：
前向角散射光检测灵敏度是指能够测到的最小颗粒大小，
一般目前商品化的FCM可以测量到0.2-0
.5μm左右。
4、FCM分析速度：分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度
超
过FCM
仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间（dead time）。死时间越短，我们说这台仪器处理数据越快，一般可达3 000个s-6
000个s，
大型机已达每秒几万个细胞。
5、FCM分选指标：分选指标主要包括：分选速
度、分选纯度及分选收获率。分选速度
指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式带分选的仪器，它的分选
速度为300个s，大型机
的FCM最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度是指被分选出的细胞所
占的百分比，
一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%。分选收获率是指被分选出细胞与原来溶液
中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低；
反
之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序的排着队，而是随机的。
因此，一旦两个
不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同的条件下，仪器会作出取或
舍的决定。因此，选择不同模
式要视具体实验要求而定。图1-2-12为两种细胞分选原理示
意图。
9
图1-2-12 细胞分选示意图
（左：通道式分选；
右：电荷式分选）
(三) 流式细胞仪补偿设置
众所周知，流式细
胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，通过荧光将488nm
或其他波长的光转变为另一波长
的光；并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算
机统计处理变为可读数据。
现在流式细胞上常用的荧光素有：
激发波长
发射波长
FITC 488nm 525nm
PE 488nm 575nm
PE-TR
488nm 615nm
PE-Cy5.5 488nm
667nm
PE-Cy7 488nm 767nm
（以上五种荧光染料可在Coulter XL或BD Calibur或Partec,PAS,Cy
flow，Cytomation,Moflo
机型上使用）
APC
633nm 660nm
APC-Cy 633nm
767nm
(以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用。如Coulter,Altra或BD
Calibur或Partec
Cyflow ML或Cytomation, Moflow) <
br>以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是
正态或偏态
曲线，即有很宽的范围。如下图，为FTIC，PE的发射波长，可以看到两者的发
射波长均为偏态分布
，FITC受激后多数将光源转变为525nm左右的光；PE多数将其转变
为575nm左右的光。故
在流式细胞仪中对FITC检测525nm附近的光，对PE则检测575nm
10
左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。
图1-2-13 受激光照射后FITC和PE分子发射光谱互相干扰图
根据上
图中FITC和PE发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时，PE荧光探
测器便会误检由FI
TC发射的575左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入PE荧光
信号中，从而引起错误。同样
PE受激后也会发出小部分525nm左右的光，进入FITC荧光
探测器中。此时就需要进行一系列仪
器设置，人为地去除该部分干扰。
现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的FITC、PE等荧光分子
性状十分相近，其发射
光的光谱分布也十分稳定。通过一系列调节，可以推算出漏入其他荧光探测器的信
号占本探
测器信号的百分比；一但设定该值，计算机会在其他探测器中减去根据本探测器的信号乘以百分比后的数值。如图：
图1-2-14 FITC无PE荧光检测补偿调节示意图
图1-2-15 PE无FITC荧光检测补偿调节示意图
11
其他荧光的补偿调节原理也同上图，如做FITC、PE、PE-
Cy5三色荧光分析原则上需要
调节的补偿有：FITC-%PE，PE-%FITC，PE-
Cy5-%FITC，PE-Cy5-%PE，FITC-% PE-Cy5，
PE-% PE-
Cy5六组补偿，即有2
3
种组合。
由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处
理，所以525nm或其他波长的光信号
可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路
的后面，故补偿过程中的百
分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。
补偿最终要达
到的效果是：漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号x N%=0。由此补偿的百分
比数值
将随着各灾光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。
要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。
如现进行FIT
C、PE双色分析，先准备该试剂的阴性对照管：
A：IgGFITCIgGPE，通过调节电压，使
阴性群体落在FTIC及PE双阴性区。（注：在
进行调补偿时，必须将原补偿全部归零）
图1-2-16 PE和FITC分子的阴性对照
阴性对照在此处的作用是调
节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实
际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动
物免疫球蛋白。由于化学键、生物键及分子之
间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细
胞仪上可检出一定的信号。当荧
光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性
对照的信号），和
特异性结合信号。所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并
将其
归入统计范围。
B： FITC标记抗体IgG-PE
12
图1-2-17 未调补偿的双参数直方图
上图为未调补偿
的双参数直方图。如在理想情况下（没有荧光干扰），因为检测管中只
含有PE标记的IgG阴性对照（
如同A管一样），所以仍将没有何任信号出现。但实际情况
并不如此，在PE坐标上出现了阳性信号。这
个信号就是由于FITC荧光漏入PE探测器中而
引起的。此时就要取一合适百分比与FITC信号相乘
后去抵消PE中的信号。（此时电压已通
过阴性对照设定，绝对不可变动！）
通过调节补偿参数如下图：
图1-2-18
A管FITC荧光信号补偿的调节
打个比方，通过A管已将FITC、PE的荧光信号设为
零；此时检测FITC标记抗体与PE
阴性对照，FITC信号假设为1000，漏入PE的信号为20
0。在补偿调节1号位时，补偿数
字为5%，通过计算得出PE信号：200-1000x5%=150
；此时1号位的补偿不足。同理2号位
的补为15%，此时PE信号为：200-1000x15%=5
0；补偿仍显不足。3号位的补偿为20%，
PE信号为：200-1000x20%=0，补偿调节良
好。4号位补偿为30%，PE信号为：
200-1000x30%=-10，此时补偿调节过头，PE
的信号会比原来的本底还低。补偿调节不足或
过头都会造成不准确的结果，所以要避免以上两种情况的出
现。
当将FITC漏入PE的信号恰好全部减除时，即PE信号与原来本底相同时，此时的补偿
便是正确的；即FITC单阳性细胞的PE的平均荧光强度与双阴性细胞PE荧光强度一致。
图1-2-19
FITCPE双阴和FITC单阳荧光示意图
对于FITC阳性细胞，通过调节补偿需将P
E中的信号恢复至与其本底一至。由上图可
知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况；即通过A管
调节电压确定阴性范围。其
次，在检测FITC标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能
有本底参照将PE
13
的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿。
同理，如检测C管：FITC阴性对照PE标记抗体，可将PE漏入FITC中荧光去除。但
前
提条件是在C管中要存在FITCPE双阴性细胞和PE单阳性细胞。
图1-2-20
FITCPE双阴和PE单阳荧光示意图
在流式细胞上，当PE单阳性细胞的FITC平均
荧光强度与双阴性细胞的FITC平均荧光
强度一致时，补偿便调节完毕。
在做多色分析时，
必须做荧光之间的补偿。方法如上，先准备各种标记的荧光阴性对照，
调节确定合适的放大电压。逐管加
入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照，然后调
节特异性荧光对每个荧光的补偿。
在
日常工作中，我们可以用CD4CD8，或CD3CD4CD8多色抗体来调节荧光补偿。现
将其原理及
方法解释如下。
在人外周血中，存在有T、B、NK等白细胞。当加入CD3-PE-
Cy5CD4-FITCCD8-PE
三色荧光抗体时，会出现以下几种情况：
CD3-CD4-CD8-细胞群：如B细胞
CD3+CD4-CD8-细胞群：如NK细胞
CD3+CD4+CD8-细胞群：如辅助型T细胞
CD3+CD4-CD8+细胞群：如杀伤型T细胞
由此可知，无论对于哪一个荧光参数都存
在阴性细胞群及单阳性细胞群；这就满足了调
节补偿的基本要求。已知不存在CD3-CD4+和CD3
-CD8+阳性细胞，又已知PE-
Cy5对于
PE和FITC的干扰很小，所以不用考虑CD3-PE-Cy5荧光对CD4-FITC、
CD8-PE
荧光的干
扰（不会有假阳性存在）。补偿调节如下：
图1-2-21 CD3-PE-
CY5、CD4-FITC和CD8-PE荧光相互干扰的补偿
14
在许多实验中，会用到某一标记物进行设”门”情况。此时最终观察的单参数结果而非双
参数，所以
往往会忽略其中补偿的问题。在这种情况下调节补偿的方法又略有不同，只要清
楚地理解补偿的形成及调
节原理，便能解决问题。详细的方法见有关章节涉及设”门”的实验
方案。
15
第二章 流式细胞术样品制备及分析技术
第1节
样本单细胞悬液的制备方法
一、新鲜实体组织样本的制备
FCM对单
细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特
点，可选择不同的分散细胞方
法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已
形成了标准化的程序，但实际操作中总会出
现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细
胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性
质、形态、结构、功能等。所以，
在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响
。现在已有专门的样
本制备仪（见图2-1-1），但有些标本仍需要人工进行细胞分散。目前常用的分
散组织细胞的
方法有如下3种。
图2-1-1
流式细胞术自动细胞分离器（BD，Medmachine）
（一） 酶消化法
1、作用原理：
对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①
可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维
等；② 可以水解组织间的粘多糖等物质；③ 可以水解组织细胞
间的紧密联结装置的蛋白质
物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶
类试剂有：蛋
白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽
的糖
苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞
间不同组分有特异
作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2、注意事项：
①
酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②
要注意酶的使
用浓度和消化时间；③
要注意酶活性的pH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋
白酶在中性溶剂中活性不佳等；④
要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。
3、方法学程序
（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；
16
（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；
（3）一般消化20-30 min（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；
（
4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去
细胞碎片；
（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。
（二） 机械法
机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀
浆器制成
组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获<
br>得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。
1、剪碎法：
（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
（2）用剪刀将组织剪至匀浆状；
（3）加入10ml生理盐水；
（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
（5）离心沉淀1000
rpm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800
rpm）短时
离心沉淀去除细胞碎片；
（6）以300目尼龙网滤去细胞团块；
（7）细胞用固定液固定或低温保存备用。
2、网搓法
（1）将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；
（2）把剪碎的的组织放在网上，以眼科
镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直
到将组织搓完；
（3）收集细胞悬液，
500-800 rpm离心沉淀2min；
（4）固定细胞或低温保存备用。
3、研磨法
（1）先将组织剪成1-2
mm
3
大小组织块；
（2）放入组织研磨器中加入1-2 ml生理盐水；
（3）转动研棒，研至匀浆；
（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；
（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 rpm，1-2
min，再以生
理盐水洗3 遍，离心沉淀；
（6）固定或低温保存细胞悬液，备用。
（三） 化学处理法
1、作用原理
化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。
2、试剂的配制
（1） 0.2%EDTA配制：称EDTA
0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。置0℃-4
℃保存；
（2）
胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，EDTA 0
.2g
加PBS（pH7.0）100ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时
过滤即
可使用。
3、实验方法
17
（1）将组织切成薄片，置入试管中；
（2）首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；
（3）再加入胰酶-
EDTA液5ml。在37℃恒温水浴振荡器内30min；
（4）用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000 rpm，5min。再以生理盐水洗2-3次；
（5）细胞固定或低温保存备用。
以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的
方法。实验证明，用化学试
剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不
稳定；化学试
剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低
；
酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据
实
验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。
（四）注意事项
1、新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产
生中心组织
坏死以及细胞自溶，影响FCM测定结果；
2、根据实验目的选择最隹的固定方法
，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的
不稳定；
3、酶学法要注意条件的选择和影
响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方
面对酶消化法的影响。
4、需注意不
同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞
瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌
以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；
往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单
分散细胞；
5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺<
br>癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在Ca
2+
、Mg
2+
存在或在血清状态下
不发生活性降低的特性。
二、组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备
正常组织、瘤组织和淋巴结等
活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于
材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与
实体组织基本相似。
1、取材后立即放入盛少许PBS液青霉素小瓶中；
2、另取一只小烧
杯，杯口用300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新
鲜组织标本置尼龙网上；因标
本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取3块以上；
3、在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；
4、先剪几下，视基本无
组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细
胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍
有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS
液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集
细胞；
5、细胞加固定液或低温保存，备用。
三、石蜡包埋组织样本的制备 <
br>石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访
资料通过病
理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡
包埋组织制备单细胞方法
介绍如下。
1、实验方法：
18
（1）把石蜡包
埋组织切成40-50um厚的组织片3-5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒
状，放入10ml的试管中；
（2）加入二甲苯5-8ml, 在室温下脱蜡1-2
天，视石蜡脱净与否，更换1-2 次二甲苯，石
蜡脱净后，弃去二甲苯；
（3）水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10
min，去乙醇，加
入蒸馏水3-5 ml，10 min 后弃之；
（4）消化：加入2
ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置37℃恒温水浴中消化30 min，
在消化期间，每隔10min 用振荡器振荡1次；
（5）消化30 min
后，立即加生理盐水终止消化；
（6）经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第2次消化；
（7） 收集细胞悬液，离心沉淀1500 rpm ,再以生理盐水漂洗1-2
次，离心沉淀500-800 rpm
去碎片；
（8）保存细胞备用。
2、注意事项
（1）
一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第1遍应在1
2小时左右，第2遍为30min左
右。检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇，
如果无絮状物浮
起，即可视为蜡已脱净；反，则蜡尚未脱净；
（2）
消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化；
（3）
切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。
（4）
消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37℃，然后用
尖吸管吹打成悬液状；
（5）
消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在300目尼
龙网上，用底部圆滑
的试管磨碎，再用PBS液冲洗一下；如此反复，就能得到较多
的单细胞悬液。
四、外周血单个核细胞样本的制备
血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞
在生理状态下呈分散的游离状态。它是
流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细
胞和血小板；而其中白细
胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。但在血细胞中一般检测单个核
细胞较为多
见。
1、外周血细胞样本制备方法的选择
一般检测细胞大分子成分
——DNA、RNA、蛋白质含量、基因表达蛋白等，多采用淋
巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液
。这样可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细
胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。外周血免疫
细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细
胞表面标志检测可采用溶红细胞法。
2、单个核细胞样品制备程序
（1） 取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4
ml ,混匀；
（2） 将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过
大，以免
造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态；
（3）
离心2000rpm,30min,室温18-20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为4 层，上
层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为
红细胞层，红细胞层
上为粒细胞层；
19
（4）
用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗2 遍，
每次均以1500 rpm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；
（5） 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。
五、骨髓细胞单细胞悬液的制备
1、制备方法
（1）
无菌抽取骨髓液0.5 ml；
（2） 将骨髓标本滴入1000uml肝素抗凝的1 ml
PBS液中；
（3） 再加入PBS液稀释至10ml；
（4） 用吸管吸取5 ml
稀释骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人类淋巴细胞分离液液面之上；
（5）
在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；
（6）
吸取有核细胞层，加入到10 ml PBS液中，混匀；
（7） 以1000 rpm 离心 5
min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。
2、注意事项
（1） 抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中；
（2）
在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，量应掌握在300 ul
左右，这样有利于洗去多
余的分层液；
（3） 溶红细胞的方法：以等量的蒸馏水加
入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现，
立即加入大量生理盐水，混匀，离心，去除上清即可。
六、培养细胞的单细胞悬液的制备
1、培养细胞的特征
一般
细胞培养分为悬浮培养和贴壁培养，由于细胞的增殖，都有可能形成大小不等的细
胞团块或连接成片。如
果两个或多个细胞粘连在一块或细胞碎片过多都将影响FCM结果，
进而导致实验失败。所以，制备合格
的培养细胞单细胞悬液十分重要。
2、培养细胞样品的制备程序：
（1）将培养细胞用0.
04%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na）或0.29%胰酶消化3-7min，（根
据室温情况而
定），至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止），弃去消化液，加
PBS液；
（2）
用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中；
（3） 短时低速离心，即800-1000
rpm，5 min；
（4） 弃上清，加pH
7.4的PBS液5-8ml，低速短时离心，800-1000prm，3-5 min ；重复
2- 3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；
（5）
加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。
七、脱落细胞样品单细胞悬液的制备
在临床工作中，可以收集到大量自然
脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为
较好的单细胞悬液，提供流式细胞术分析。主要包括脱
落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷
检细胞等。
20
1、食管拉网细胞的单细胞悬液的制备
(1)
将食管拉网器上的细胞洗脱到20 ml PBS液中，以1500 rpm
离心后，再用PBS液洗
2次，离心500-800 rpm, 1-2 min，弃上清；
(2) 再加入PBS液5 ml ，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
(3)
加少许PBS液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。
2、尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备
（1） 用一清洁器皿收集24小时尿液，置4℃ 冰箱中自然沉淀2小时，轻轻倒去上清液，
留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至10-20 ml 离心管中；
（2） 500
rpm 离心 10min ，去上清；
（3） 加PBS液8-10 ml，以1000 rpm
离心10 min ，去上清；重复再洗1 次；
（4） 再加5 ml
PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（5）
再加少许PBS液，混匀。加固定液或低温保存，备用。
3、胸、腹水脱落细胞的制备
（1） 抽取胸、腹水50-100 ml ，加入1000
IUml肝素液1 ml
，放盐水瓶中置于4℃冰箱
中静置6-12 h，弃去上清；
（2）
将底部10-20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3 次，以1500 rpm 离心沉淀5
min ；
（3） 再加5 ml
PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（4）
加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备用。
4、冲洗液细胞样品的制备
（1）用300-500 ml 生理盐水冲洗膀胱,冲洗一定时间后,吸出冲洗液放入容器中于冰箱
内置6-12 h；
（2） 取沉淀液20-40 ml ,离心沉淀并以生理盐水洗2
次, 吸上清；
（3） 加10 mlPBS液，混匀；以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（4） 过滤后1000 rpm,10 min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。
第2 节 样品的荧光标记和检测分析
一、荧光标记原理
定量细胞荧光染色，要求细胞成分染色的均匀性，保证染色做到染料分子数与被染的某
种参量成
一定的量效关系。在流式定量分析中，掌握好荧光染色液的浓度非常重要。为了更
好地说明这个问题，可
以用下式表示：
F=Q(I-eεCL)
式中F表示荧光强度， Q表示光量子产额，I表示激发光强度，ε表示消光
系数，C表示染
色浓度，L表示浓度厚度。当激发光增强时，荧光强度相应按比例增加；当荧光强度达到
1.0时，继续增强光密度，荧光不仅不会增加，还会造成结合到细胞上的荧光素发生猝灭现
象
。一个荧光分子发射的荧光，有可能被邻近的分子吸收淬灭。由于这种淬灭现象，如果再
增加荧光染料浓
度也不会使荧光强度增大。
1、荧光染料与细胞参量结合的方式
（1）共价键结
合：DNA链的连结之间被打开，形成与荧光染料分子共价键结合，这种结合
方式不十分稳固，冲洗过多
易造成荧光分子丢失。例如异硫氢酸盐荧光素(fluorescein
isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（phycoerythrin,
PE）等这些荧光染料。
21
（2）嵌入性结合：荧光染料分子直接嵌入到
核酸分子的碱基对之间。这种方式结合紧密、
稳固，不易造成荧光分子的丢失。如碘化丙啶（Propi
dium iodide, PI）、溴化乙啶（Ethidium
bromide, EB）等。
（3）结构亲合结合：以静电力结合，带正电核的荧光分子与带有负电核的核酸结构中的磷
酸基
相互吸引而结合。这种方式结合极弱，易造成荧光分子丢失。例如吖啶橙与核酸单链结
合时，派若宁Y与
单链核酸结合均系静电力结合方式。
2、荧光素发射荧光的基本原理
当应用流式
细胞术对细胞表面或内部抗原进行检测时，除必要的抗体外，各种荧光素也
是必不可少的。它包括：单标
记抗体荧光素、双标记抗体荧光素、三标记抗体荧光素，……
等。荧光素发射荧光基本原理是：荧光素受
到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子
核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础
态轨道跃迁到激发态轨道上运动，
然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长
（发射波长）的荧光。
不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发,所以要选择正确的激光器。例如
，ascade blu
需用紫外线激光器，FITC和PE等的激发波长均为488nm，所以可用
产生可见光的氩离子
激光器，而APC和PC5等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm
波长红光的氦-氖激
光器。
另外，各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所
需光电倍增管性质。
如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）
；PE则发射
橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5和PerCP等，发射的是深红色光
，这时需
选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3或PMT4）,等等。
3、常用荧光素的基本生物学特性：
主要荧光素包括：PI、EB、FITC、PE、PC5
、PerCP、Cy5、Cy7、
APC等。单色或双
色分析时，最常用的荧光素是FITC和
PE。
(1) PI和EB：都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并有与碱基对结合的特异
性。
为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。PI
和EB不能进入完整的细胞膜，因此又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，
但PI
比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在作DNA和蛋白质双参数测量时，PI
的红色荧光和FI
TC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA分布的变
异系数（CV值）低，所以
PI 得到更广泛的应用。
（2） FITC ：为一种小分子荧光素，其效率，即荧光强度，取决于
溶液的pH值，因此在
使用FITC时，应注意溶液的酸碱度。
（3） PE：其分子量较大
，为240KD，故可能会对其它大探针产生空间位阻。但PE的化
学结构非常稳定，有很高的荧光效率
，并易与抗体分子结合。这里需要注意的是PE作为天
然染料，因来源程序不同，可能造成荧光素结构上
的微小差别，导致其特征的不一致。因此
用不同公司生产的PE可能会得到不同的结果。
（4） 其他荧光素 单激光束三色荧光分析时，要求单激光激发，所选择的三种荧光素的发
射光波长应该有所不同。除FITC（发射绿光），PE（发射橙光）外还应选择发射红光或深
、叶绿素
蛋白（Peridinin
红光的藻红蛋白-花青素（
phycoerythin and
Texes Red tandem，PC5）
Chorophyll
protein，PerCP）或藻红蛋白-德克萨斯红（Phycoerythin and Texes
Red tandem，
ECD）。因为这些荧光素在受到488nm的蓝光激发后，均发射出红色光或
深红色的发射光。
① PC5和ECD是由在空间结构上互补的两个荧光素分子通过共价键结合而成，组
成一个荧
光分子。PC5由PE和Cyanin 5 组成，ECD由PE和Texes Red
组成。它们前一个分子的发
22
射光波谱与后一个分子的激发光波谱相重合，
这样当前一个分子受激光激发后，产生的发射
光可直接激发后一个分子，最后由后一个分子的发射光体现
出整个组合的荧光特性。因此，
从组成上说是两个分子，但表现为一个分子的物理性质。② PerCp
是一种生活于深海区域
的鞭毛虫中发现的色素，其功能为将可渗透入深海的蓝光传递至鞭毛虫的叶绿素发
色集团，
进而发出红光。需注意的是PerCP为一单个分子。③ 别藻蓝蛋白（allophycoc
yanin，APC）
和花青素5（cyanin，Cy5）这两种荧光素的激发光波长要求在630n
m左右，需第二激光束
来激发。各种荧光标记的抗体与细胞结合的的原理模式见图2-2-1,常用染料
的激发光及发射
光波长见表2-2-1：
图2-2-1
荧光标记抗体与细胞结合原理模式图
APC
23
表2-2-1 常用荧光染料的激发光和发射光波长分布
荧光染料
Indo-1 (unbound)
Indo-1
(Bound to Calcium)
Hoechst 33342
DAPI
Alexa350
PerCP
R-Phycoerythrin
Green Fluorescent
Protein (GFP)
YO-PRO-1
FITC
Fluorescein diacetate
Alexa488
Sytox Green
SNARF-1
Fluo-3
dsRED
PE-Cy5 (TriColor, Cychrome)
PE-Cy7
ECD
Propidium Iodide
Rhodamine 123
Yellow Fluorescent
Protein (YFP)
LDS-751
7-Aminoactinomycin D
Alexa 546
Cy3
CMXRos (Mitotracker Red)
Texas Red
TO-PRO-3
Alexa
647
APC-Cy7
Allophycocyanin
(APC)
激发光.发射光.
335
335
350
359
350
470
480
488
488
488
488
488
488
488
488
488
488
488
488
495
515
519
543
546
546
550
560
596
643
647
647
650
应 用
490
Calcium Flux
405
Calcium
Flux
470
DNA analysis
462
DNA analysis
442
Phenotyping
670
Phenotyping
578
Phenotyping
510
Reporter
molecule
510
Apoptosis
analysis
525
Phenotyping
530
Cell viability
530
Phenotyping
530
DNA
analysis
530-640
pH measurement
530
Calcium flux
588
Reporter molecule
670
Phenotyping
770
Phenotyping
620
Phenotyping
637
DNA analysis
525
Membrane potential
534
Reporter molecule
712
Nucleated cell detection
655
DNA analysis
573
Phenotyping
565
Phenotyping
610
Mitochondrial
membrane potential
615
Phenotyping
661
DNA
analysis
667
Phenotyping
774
Phenotyping
660
Phenotyping
24
4、定量荧光染色的评价标准
⑴
特异性，荧光染料是否和所研究的细胞成分为特异性结合；
⑵
在相同实验条件下，荧光强度与检测的细胞成分呈严格的正相关关系；
⑶
使用荧光显微镜检查，荧光的分布是否具有一个核形态结构，荧光分布是否一致，并
可看到一个粗大的荧光颗粒
⑷ 用FCM分析评价，以DNA含量分析为例，在组方图上第
一个峰（G
01
细胞峰）与第
二个峰（G
2
M期细胞）是否成倍数关
系。
5、影响样品荧光标记的因素：定量细胞学的荧光染色易受多种因素影响，以至导致不
正确
的实验结果。其主要因素如下：
⑴ 温度的影响：在一般情况下，荧光染色的环境温度
对结果有明显影响。因为温度升高，
可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子动力加大，使荧光猝灭
（随荧光染料浓度增加，
荧光分子被邻近分子所吸收而荧光量子产额降低的一种现象）的可能性也随之加
大，这就使
荧光分子和其它分子之间相互碰撞机率明显增加；因此影响了荧光分子发光量子的产额。温<
br>度升高时，荧光量减弱。一般在20℃以下，荧光分子发光产额的变化不明显，基本保持恒
定。
⑵ pH值的影响：荧光分子在溶剂中基本上处于离子化状态。因此，溶剂中的氢离子浓
度对
荧光强度的影响是极大的。荧光染料发光最好条件是在溶剂中处于离子化或极化状态。
每一种荧光染料分
子发光量的产额最高时均有最适pH值，以保持荧光分子与溶剂间的电离
平衡。如果pH值发生改变，可
能造成荧光光谱的改变。也可造成荧光强度的降低。
⑶ 荧光染料浓度的影响：在荧光染色过程中，
必须保证使用的荧光染料浓度与荧光强度
呈严格的正相关关系。但是，每种荧光染料在溶液中随浓度增加
，其发光功能都存在一种猝
灭现象。这主要是缔合分子的形成，缔合分子本身具有猝灭作用，是因为缔合
分子中的电子
共振作用，而消耗了激发分子的能量而参与猝灭作用。所以，当溶剂稀释荧光染料分子之间
的相互作用完全消失时，荧光量子的产额最大，发射的荧光强度最强；当溶液浓度增加时，
荧光
分子之间就发生碰撞效应，缩短了电子处于激发状态的时间，使得非辐射跃迁几率增加，
从而引起荧光量
子产额下降。同时，荧光染料分子浓度过高，也容易产生内滤光效应。所以。
选择合适的荧光染料浓度，
对于荧光定量检测技术是十分重要的。
⑷ 杂质对细胞荧光染色的影响：杂质对荧光的猝灭作用，是
由于溶剂中含一些不发光
物质。这些物质存在，使荧光分子受光激发后与其它分子相互作用，使荧光分了
光量子产额
减少而造成猝灭现象；还有些杂质可以与荧光分子结合形成新的化合物，使吸收光谱发生改<
br>变，使荧光量子产额降低。
⑸ 细胞固定剂对细胞荧光染色的影响：一些插入性荧光染料在应
用中需要使用一些固
定剂时，有些固定剂与细胞某些物质结合，干扰了插入性荧光染料与细胞成分的结合
，造成
荧光发射强度的改变。如染色细胞DNA时应用醛类（戊二醛、甲醛等）固定剂，可使荧光
强度降低50%左右；而醇类固定剂则相对影响较小。因此，对荧光定量检测中，细胞固定
剂的选择也
是十分重要的。
⑹ 其它影响因素：溶剂的性质、浓度对荧光的猝灭也有一定的影响。例如，光神霉
素在
盐水溶剂中，NaCl 1.9%以上时，对荧光强度有明显影响，0.9-1.8%浓度时，荧光
强度相似；
<0.9%浓度时，荧光强度减弱。
因此在利用荧光染色技术检测细胞某种成分含
量时，为了得到正确的测量值，就必须对
能影响荧光强度的众多因素进行严格控制，才能得到满意的结果
。
二、细胞破膜剂的应用
25
1、细胞破
膜剂应用的意义：用流式细胞仪检测细胞DNA、内抗原，如与细胞凋亡有关的
p53蛋白、Bcl-2
蛋白、及细胞内因子IL-4、IFN-r等，均需要首先使流动的、完整的细胞膜
产生可通透抗体的小
孔，即所谓的破膜过程。破膜的好坏直接影响荧光染色的效果和结果的
分析，特别是在细胞内外抗原同时
检测时，尤其重要。
2、细胞破膜剂的种类：
（1）选择破膜剂的原则：①
能保持细胞的形态，在用前向角(FSC)侧向角(SSC)分析时，
能准确定位不同细胞种类；②
细胞膜表面抗原的抗体结合能力保持良好，细胞表面抗原检
测可靠性高；③
能同时准确地检测细胞内外的抗原。
（2）几种常见的细胞破膜剂：① 0.05%
皂角素（saponin）,② 0.1%曲拉通（triton X-100），
③
70%乙醇（ethanol）。
3、几种破膜剂对细胞形态的影响的对比：① 经3种破膜剂处理
后，外周血细胞的散射光
图对比发现，用皂角素破膜，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞3群细胞可清晰分辨
，其相对百
分比与未处理的血细胞相似；而用triton X-100和乙醇处理者，淋巴细胞和单核
细胞群很难
分开，尤其是乙醇处理时，单核细胞与粒细胞已完全重合在一起，这主要是皂角素可较好的<
br>保持细胞形态，而其它两种破膜剂会使细胞皱缩的结果；② 破膜剂影响抗原的表达：以
CD8
抗体标记为例，比较CD8标记后再破膜和破膜后再标记CD8，结果发现：表面抗原标
记后，细胞再破
膜，几种破膜剂对CD8表面抗原的表达均无明显影响；如果先破膜，后标
记，triton X
100 和乙醇破膜则使表达CD8抗原细胞比例和每个细胞上抗原表达量急剧下降；
而皂角素对这两个
指标均无明显影响。对CD45RO和Fas的研究还发现，triton X-100和乙
醇对其表达
有显著影响，使其表达率下降；这三种破膜剂对细胞内IL-2检测结果影响不大；
检测IFN-
r时，皂角素与乙醇相似，而用tirton X-100，则其表达率显著降低；检测TNF-α
时，
皂角素的敏感性显著高于另外两种。总之，皂角素是比Triton X
100及乙醇更理想细胞
破膜剂。
三、溶血剂的应用
溶血，
裂解红细胞是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好
分开。所以，溶血好坏直
接影响检测结果。为此，必须对溶红细胞过程进行全面了解并严格
控制溶解红细胞的条件。
1
、溶解红细胞的基本原理：首先，使溶血剂进入血细胞，包括红细胞和白细胞；然后，加
入比溶血剂渗透
压低的溶液，这样使细胞内外渗透压不等，使渗透压低的溶液能充分进入细
胞内。又因为白细胞膜抗性较
好，能保持细胞完整形态；而红细胞膜抗性较差，当低渗透溶
液进入红细胞后，最后将红细胞膜涨破，从
而达到溶解红细胞的目的。
2、使用溶血剂的注意问题：① 溶血剂与血细胞充分混匀；②
溶血时间不宜过短或过长,
一般5-15 min，见血液完全透明后方可；③
采用不同厂家溶红细胞液，严格按各厂家说明
书上步骤进行操作。
3、溶红细胞液制备方法
红细胞溶解液主要用于 有核细胞表面标志性蛋白抗原的检测。它是
目前应用最广泛的
制备单个核血细胞悬液的重要方法之一。各厂家均有商品上市，如联科生物公司生产的
caltagcal-lyse溶血剂。同时，各实验室也自行配制，具体配制方法如下。
碳酸氢钾（KHCO
3
）1.0g
氯化铵（NH
4
CL） 8.3g
26
EDTA-Na
2
0.037g
加双水至1000ml，即为工作液。
第三节
免疫细胞的样品制备和分析
一、基本原理：
机体免疫状态是机体是否罹患疾病的
重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免
疫状态，其中最重要的指标是T、B和NK淋巴细胞的
水平。其中T细胞又主要包括Th和
Ts细胞亚群。CD3细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应
约等于CD4+细胞和CD8+
细胞的总和。但我们检测患者T细胞及其亚群时，往往出现CD4+加C
D8+细胞之和大于CD3
的情况。这是因为CD4+细胞其实包括两面部分：CD3+CD4+细胞（
真正的Th细胞）和
CD3-CD4+细胞（非Th细胞）；CD8细胞也包括两部分细胞：CD3+C
D8+细胞（真正Ts细
胞）和CD3-CD8+细胞（非Ts细胞）而后者又可以分为两组：一组为C
D3-CD8+CD（16+56）
+细胞（即NK细胞的一部分）；另一组为CD3-CD8+CD（
16+56）-（一群未知细胞）。由
此可见，真正的Th细胞是CD3+CD4+细胞，真正Ts细
胞是CD3+CD8+细胞若使用CD4
或
CD8单标单抗或CD4与CD8双标抗体来检测T
h和Ts，而不用CD3抗体进行限定，测
出的结果必然会偏离真实值。尤其当患者NK细胞明显增加时
，会使CD4细胞和CD8细胞
的总和远大于CD3+细胞因此，一定用三色荧光标记才能分析真正的辅
助性T细胞和抑制性
T细胞。首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在CD3细胞中再区分CD4+
和CD8+细胞。
自然杀伤细胞（NK），又称裸细胞，因其表面没有类似T细胞和B细胞的表面标志，
后来
随着免疫力学的发展，发现NK细胞的一些表面标志，如CD16、CD56等，但单用C在先 和
CD56的抗体无法正确鉴定出NK细胞，因此必须使用CD（16+56）抗体。这里还有一点必须引起足够重视，即NK细胞一定是CD3阴性表达细胞。所以CD3-CD（16+56）+细胞才
是真正的NK细胞。根据是否表达CD8 ，又可将NK细胞分为CD3+C左+C在先+56）+
细
胞（前面已提及，这部分细胞在NK细胞中所占比例较小，因此一般不会影响CD8的比
+细胞（这NK
细胞的主要成分）。B细胞的表面标志是CD19，
例）和CD3-CD8-？参政
+56）<
br>理论上CD3-CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但实际检测中，CD3+CD19+细胞很少，<
br>可以忽略不计。所以CD19+细胞就是B淋巴细胞。`
利用抗原抗体特异性反应原理，将不同
单克隆抗体设法带上各种荧光染料作为荧光标记
（荧光探针），而这种荧光探针与单克隆抗体能牢牢结合
；当细胞被激光器发射的激光照射
后，细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同光谱的继发
荧光，带荧光探针的
单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧光量转换成电信号，这就代表了细胞
表面的
抗原量；这些荧光通过流式细胞仪的识别和分辨，从而实现对细胞表面抗原的定量检测。细
胞免疫反应一般分两种：直接免疫反应，即细胞表面抗原与带荧光探针的单克隆抗体特异结
合的免疫反
应；间接免疫反应，细胞表面的抗原与单克隆抗体结合，带荧光的第二抗体又与
抗体结合，也使这个抗原
-抗体复合物也带上荧光探针。
27
图2-3-1
同型对照用于设定十字门的位置。
要求：双参数直方图左下区域， 即R3区的细胞需为总
细胞数的98%-99%。因此，图
2-7-1之1a的R3区中包含的细胞过多(99.95%)，而
图1b则细胞过少(97.52%)。图1c的十字
门位置适当。有时在右上区域(R2区)的对角线位
置处会出现额外的细胞群，即通常所说的
“火箭峰”，这时，十字门的交叉点应该设在R3区中接近阴
性细胞群的位置(如图1d)。只有
在这种情况下，才允许R3区中的细胞群比例低于98%.
二、淋巴细胞亚群分析：
1、双色分析方案：见表2-3-1
CD45-FITCCD14-PE
CD3-TC-CD4-PE- CD8-FITC
CD3-FITC CD16+56-PE
CD19-TC
Cal-Lyse
Control IgG2a-FPT
表2-3-1
双色法检测外周血T、B、NK细胞试剂组合
Tube Number
FITC
1
2
3
4
5
CD45
CD14
CD3
CD3
CD3
CD3
CD19
CD4
CD8
CD16 and
CD56
PE
Use
光散射坐标设门
总T和B淋巴细胞
总T和CD4阳性T淋巴细胞
总T和CD8阳性T淋巴细胞
总T和NK细胞
2、三色分析方案：见表2-3-2
管A：CD45CD14 确定FS Cvs SSC
中淋巴细胞门位置 （详见下），此管对于自配溶
血剂用户必做此质控管。
管B：阴性对照管，用来设置各PMT电压和阴性区域。
管C：CD3CD4CD8三色检测管，监调节荧光补偿之用。
管D：CD3CD16+56CD19三色检测管。
28
表2-3-2 三色法检测外周血T、B、NK细胞的试剂组合
Tube
Number
1
2
3
CD45和CD14在白细胞上有着不同的表达，固它们可用来在光散
射坐标上区分淋巴细
胞群体或其他细胞。一个适当的分型方案应能够提供最精确地、明确地区分出各类细
胞亚群。
方案中所选抗体应能够最大限度地反应出整个标本中细胞的信息，提供样本管之间的对比质控来保证各个测定管之间的结果的一致性。方案设计中不仅要检测阳性标本，还要包括阴性
群体来作
阳性标本荧光强度的对照。美国疾病控制中心制定了一套检测T淋巴细胞亚群的
方案，可作为参照来检测
样本。
3、用CD3CD19区分T淋巴细胞和B淋巴细胞
在多色免疫分型
分型中，阴性细胞群体不仅用来区分阳性细胞群体，它还可以从双阳性
细胞中区分出单阳性细胞。鉴于此
，简单的同型对照细胞并不能完全作为设定荧光阳性界线
的参考细胞群。在CDC推荐的淋巴细胞分型方
案中，对照细胞群体运用的是相互没有交叉
的T、B淋巴细胞。
① CD3是T细胞特异性抗
原，CD19则可用来识别B细胞。如运用CD3CD19双标试剂，
应没有CD3和CD19双阳性细
胞群体存在。因此当运用CD3CD19双染色时，只会出现单
阳性细胞，通过此管可设定机器设制，为
后续要观察双阳性细胞的检测管作对照。
② CD3、CD19阳性表达为独立的阳性细胞群体。如出
现双阳性细胞均视为假象。这样就
可不用同型对照来设定阴性或阳性界线。其中单阳性细胞群体提供了设
定阳性界线的标准。
此外在CD3CD19检测时，还会有双阳性细胞群体的存在，这些是NK细胞。这
些细胞又提
供双阴性群体的对照。（有时检测时会出现双阳性细胞，这是由于T细胞和B细胞粘附时同
时通过仪器的检测区而造成的双阳性结果）
③ CD3CD19不仅可用来设定标本的荧光的
阴性和阳性界线，它还可用来检查仪器的补
偿设置和非特异性结合。在用这个组合进行检测时，会出现三
群彼此独立的细胞群，如细胞
分群不清或位置发生偏差则要对样本进行仔细分析。
4、运用CD3CD4来鉴定CD4+T淋巴细胞
如同其他许多单克隆抗体一样，抗CD
4抗体并不是完全只与辅助诱导性T细胞发生反
应，它还会与单核细胞结合。因此如要鉴别CD4+的辅
助诱导性T
细胞则需要加入第二种
抗体来区分辅助诱导性T细胞与单核细胞。
(1)
首先用CD3来区分全部T细胞。CD3CD4双阳性的为真正的辅助诱导性T细胞。这
此细胞主要是H
IV病毒感染对象。在HIV感染后，随着疾病的发展出现免疫抑制后，这群
细胞会明显下降；在临床中
，对HIV的鉴测主要依靠检测这群细胞的数量。
(2) CD3-CD4+细胞群体是由单核细胞组
成的。这些细胞相对于CD4+和T细胞来说弱表
达CD4，在光散射参数的位置分布也较广。CD3C
D4抗体组合能完全区分将CD4阳性辅助
诱导性T细胞与CD4阳性的单核细胞相区分开来。因为CD
4+T细胞能与单核细胞完全分
离，固在光散射坐标上设淋巴细胞”门”时，”门”可设得大一些，即使
包含了单核细胞或其他
细胞都不会影响检测值。
29
FITC
CD45CD14
CD8
CD4
PE
CD3
PE-Cy5
X
Use
光散射坐标设门
T细胞及其亚群
NK细胞及B细胞
CD3
CD16 and CD56
CD19
(3) 此管也可检测补偿及非特异性结合情况。CD3+CD4-
细胞群体应明显地与CD3CD19
中CD3+细胞群位置相重合。
5、运用CD3CD8鉴定CD8+T淋巴细胞
CD8的表达不只限于T-
细胞毒性抑制细胞，这种抗原在部分NK细胞上也能检测到，
故CD8必须与CD3一起来鉴定T-
细胞毒性抑制细胞。
（1）
同时表达CD3CD8的细胞群才是真正的CD8+T淋巴细胞，CD8的表达
包括弱阳性和强阳性部
分。CD8的表达经常与阴性细胞群体相延续。因此CD8阳性细胞检
测群依赖于仪器灵敏度，正确补偿
的建立，以及恰当地设定阴性细胞群体。
CD3-CD8+细胞包括一部分
NK细胞和少数粒细胞。这些细胞弱表达CD8+，由于
缺少CD3，易于从CD3+CD8+
T淋巴细胞相区别。
（2）双标试剂可以用来检查补偿设制和非特异性结合情况。双阴性细胞可视作内部的阴
性对照。CD3阳性群体应与CD3CD19、CD3CD4中的CD3阳性群体处于同一位置。
6、NK细胞
（1） CD16(FcRIII)表达于大多NK细胞上,但
也表达于中性粒细胞上.这种抗原在NK细胞
的表达比较弱并在
NK细胞活化时丢失,。
（2） CD56表达于大多数的（但并不是全部）NK细胞上, 也表达于一些T淋巴细胞上。
与CD3联合使用,可以区分CD3+CD56+ T淋巴细胞和CD3-CD56+NK细胞。
（3）联合使用三种单抗能最完全的鉴定所有的NK细胞. NK细胞或表达CD16, 或表达 CD56,但它们不表达CD3。CD16和CD56联合使用,根据荧光强度可将NK从双阴性细胞
中区分出来。这样运用该组试剂，NK细胞可形成独立的群体与其他细胞相区分。
7、样本检测中的内部质控：CD3的检测数量
如选用CDC推荐的方案来检测淋巴细胞亚群，这个方案中的检测管能够提供很好批间
质控：
（1） 因为所有测定管中都含的CD3，所每管中的CD3数量的差异不应超出实验室中可
接
受CV值范围。如去除实验室CV影响，测定管中CD3的最高值与最低值不应相差3%以
上。如差值大
于3%则要对数据作进一步分析，找出原因。
（2）一般来说，每个测定管中CD3的数量是极为相近
的。如出现偏差，要着重检查形态
学”门”（FSC vs SSC）中的位置，其中细胞数量或形态是
否一致；极有可能偏差是由于”门”
的位置不一致造成的。此外，要确保所加试剂量前后一致，阴性对照
界线设置要正确。
（3） 如在排除上述原因后，差异仍大于3%，则标本要弃用。
8、淋巴细胞亚群数据分析及质量控制
使用以上试剂可供区别出T、B、NK细胞：
（1）T细胞B细胞和NK细胞百分比总和应等于100%的淋巴细胞，但在实际中由于在
FSCvs
SSC中淋巴细胞设”门”中，会混入细胞碎片及单核和粒细胞，所以很难达到100%的
比例。
（2） 如运用CD14CD45设门来确定淋巴细胞”门”，则CD3细胞百分比+CD19细胞百分
比+CD3-（CD16+56+）细胞百分比应等于CD45CD14中淋巴细胞百分比±5%，最大
不得
超过±10%。
9、外周血免疫细胞检测的实验程序
30
（1） 取100μl 1000uml肝素抗凝静脉全血，置于FCM测量管中；
（2）
直接标记法：加入带荧光标记的鼠抗人目的单克隆抗体试剂10μl，充分混匀，在
4℃冰箱中反应30
min；
间接标记法：加入不带荧光标记的鼠抗人目的单克隆抗体试剂10μl，充分混匀，
反应 30
min；再加入带荧光标记的羊抗鼠抗体，反应30 min；
（3） 再加入2
ml溶红细胞液，充分混匀，在4℃冰箱中反应5-10 min；
（4）
以1500prm离心5min，去上清；
（5） 用生理盐水洗1遍，收集细胞，上机检测。
10、外周血免疫细胞检测的注意事项
人体免疫细胞的检测，主要通过细胞表
面标志——血细胞表面分化抗原的免疫分析来实
现的。在分析免疫细胞时注意以下几点：
（1
）细胞分化抗原——细胞表面标志的表达方式：可以采用两种方式来表达，即细胞荧光
强度和阳性细胞百
分比；① 细胞荧光强度表达，即在细胞分布的直方图上，细胞巅峰所处
荧光道数；②
阳性细胞百分比表达，即在检测细胞中，所有标记阳性细胞占检测细胞的百
分比。
（2）样品
检测的同型对照和正常对照：只有设同型对照和正常对照，才能增加样品检测结
果的准确性和客观性。同
型对照是指：所应用的单克隆荧光标记抗体(染色试剂)——即携带
特异性单克隆荧光抗体的免疫球蛋白
的空白对照，即只带荧光标记相同的免疫球蛋白，以此
作为对照并在分析样品时，减去同型对照的阳性结
果。样品正常对照是指：未加任何处理的
正常组织细胞,作为实验对照样品,在分析细胞时，只有与正常
对照相比，才能得出检测细胞
的异常程度或处理后样品的变化趋势。
第四节
DNA含量检测样品的染色和分析
DNA 含量检测是流式细胞仪最早，且目前仍然是其最
为广泛的应用指标之一。恶变肿瘤
细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA含量分析对人肿瘤的诊
断预后有很高的价值。
DNA含量分析还可提供细胞周期信息，所以它也可作为细胞生物学的一种有用工
具。尤其对
细胞毒性药物的研究很有价值。DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞
处于某一特定周期阶段。
使用一些核酸染料和DNA结合可对DNA进行定量分析，但这只能
反映细胞周期中的某一
静态情况，而用BrdUrd脉冲标记（pulse-labelling）细胞
及其抗体的使用或结合连续标记
BrdUrd和Hoechst33258染料则可以观察细胞循环过程
中的一动态变化过程。
在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，但DNA含量随着细胞增殖周期
各时相的不
同而发生明显的变化。G
0
期细胞被认为是不参与增殖周期循环的一群细胞
，即为静止细胞，
均为二倍体DNA
其细胞DNA含量为较恒定的2C值，G
1
期细胞与G
0
期细胞DNA值相同，
含量，当细胞DNA倍增结束，进入G2期，最
终进入M期，在M期分裂为两个子细胞之
前，G
2
和M期细胞的DNA含量均为恒定的
4C值，即为四倍体细胞群。
一、DNA含量样品的制备：
PI或EB荧光染色
方法，目前市场已有试剂盒出售，十分方便；但也可以自行配制试剂。
用PI综合染液做细胞DNA含量
一步法染色程序如下：① PI综合染液的配制：（100ml）
PI 5mg、RNAas
2mg、1.0% Triton X 100 0.5ml 、生理盐水5 ml、枸橼酸钠
100mg、加
蒸馏水至100ml，调pH 7.2～7.6， 置4℃冰箱中避光保存备用。②
将单细胞悬液或加固
31
定液细胞悬液离心沉淀弃之，用PBS洗涤2
次，调细胞浓度为1×10
6
，加2 ml PI综合染
液；③
置4℃冰箱，染色30 min；④ 离心洗去PI染液，加少许PBS液，上机检测。
二、细胞DNA含量的分析(ModiFit LT 2.0)细胞周期分析软件)
1、DNA倍体分析的理论依据：
在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA含
量随着细胞增殖周期各时相不同
而发生变化。G
0
期细胞被认为是不参与增殖周期循环
的1群细胞，即为静止细胞，其细胞
为恒定的二倍体DNA含量（2C）；G
1
期细胞
具有增殖活性，参与细胞周期循环，G
1
期细胞
与G
0
期细胞DNA
含量相同，均为2C；当细胞进入S期后，DNA含量逐渐增加，从2C→
4C，一直到细胞DNA倍增
结束，进入G
2
期，最终进入M期。在M期分裂为2个子细胞
之前，G
2
和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C，即为四倍体细胞。
荧光染料和细胞DNA分子具有特异性结合，且有一定的量效关系：①
DNA含量多少与
荧光染料的结合成正比；② 荧光强度与DNA分子结合荧光素多少成正比；③
荧光脉冲与直
方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA定量分析1个细胞增殖群时，可将二倍体DN
A含量分
布组方图分为三部分，即G
01
、S、G
2
M。G
01
和G
2
M细胞峰的DNA分布均为正态分布，S期可
以认为是一个加宽的
正态分布。
癌组织都应该含有一定比例的正常二倍体细胞：①
癌组织源于正常组织，可能残存一
些同源组织正常细胞；② 癌组织的血液供应和支持组织往往是从正常
组织延伸过来的，存
在一些纤维母细胞、血管内皮细胞及血细胞等；③ 机体免疫监视功能，大量浸润的
淋巴细
胞、巨噬细胞等。且在癌组织DNA直方图上（见图2-4-1），异倍体峰前总可以见到1个或
大或小的二倍体峰位的G
01
细胞峰。另外，显微图象分析仪做倍体检测时，都采用组
织中淋
巴细胞做对照。
图2-4-1 肿瘤组织细胞DNA直方图
（DNA异倍体G
01
细胞峰前有1个小的DNA二倍体细胞峰）
2、DNA倍体的命名原则：
流式细胞术分析肿瘤细胞DNA倍体时，应根据DNA直方图
、G
01
峰峰位和DNA指数
（DNA index, DI）来确定DNA倍体类型
。DNA倍体分为单干系和多干系，来自单个细胞
突变后的肿瘤，发展为DNA单干系肿瘤，可能为二倍
体或者是单异倍体肿瘤；来自多个细
胞突变后形成的肿瘤或者肿瘤在发展过程中出现多克隆DNA干系细
胞的肿瘤为多克隆肿
瘤。另外，在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程
发展、
或经治疗的肿瘤灶，其DNA倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA倍体异
质性。
32
3、DNA倍体分类的分析参数：
①
DNA指数（DNA index，DI）
被分析细胞G
01
期细胞峰顶荧光道数
DI=
正常二倍体G
01
期细胞峰顶荧光道数
、DNA合成期（S期）、
②
细胞周期各时相细胞比例：静止期DNA合成前期（G
01
期）
；
DNA合成后期有丝分裂期（G
2
M期）
③
增殖活性：包括S期细胞比例（S-phase
fraction，SPF）和增殖指数（proliferous index,
PI）：
S
SPF = ×100 %
G
01
+S+G
2
M
S+G
2
M
PI =
×100 %
G
01
+S+G
2
M
④
细胞凋亡指数(Apoptosis Index,
AI)：DNA二倍体细胞G
01
峰前亚二倍体峰细胞占
分析细胞的百分比（%）。
4、 细胞DNA倍体具体分类方法：
用FCM检测肿瘤细胞DNA含量时，是以
肿瘤组织中DNA二倍体细胞作内部参考细胞
来计算肿瘤细胞DNA指数（DI）；以DI值和DNA干
系数量不同对肿瘤组织DNA倍体分
类如下：
二倍体
DNA倍体 近二倍体 单克隆
单异倍体 四倍体 肿瘤起源学说
异倍体 非整倍体
多异倍体 多克隆
图2-4-2
DNA倍体分类与肿瘤克隆起源
（1） 二倍体（diploid,
D）：在组织细胞中只有1个DNA干系细胞，DI=1.00；
（2） 近二倍体(near-
diploid, ND)：在组织细胞中有2个DNA干系细胞，其中1个干系细
胞G
01<
br>峰峰位在DNA二倍体细胞峰位上，DI=1.00；而另一个DNA干系细胞，DI≠1.00，
但在0.90-1.10之间，该细胞峰为近二倍体细胞。
（3）
四倍体(tetraploid, T)：在组织细胞中有2个DNA干系细胞，其中1个DNA干系细
胞G
01
峰峰位在DNA二倍体细胞峰位上，DI=1.00；而另一个DNA干系细胞，DI
值在
1.90-2.10之间，该细胞峰为四倍体细胞。
（4）
非整倍体(aneuploid, AN)：在组织细胞中有2个DNA干系细胞，其中1个干系细胞
G
01
峰峰位在DNA二倍体细胞峰位上，DI=1.00；而另一个DNA干系细胞的DI为
<0.90
或 >1.10，但除外T细胞，该细胞峰为非整倍体细胞。
（5）
多异倍体(multiploid, M)：在组织细胞中有3个或3个以上DNA干系细胞，除有1
33
个DNA干系细胞G
01
峰峰位在DNA二倍体细胞峰位上，DI
=1.00外；还有2个或2个以上
DNA异倍体干系细胞，这些细胞群被称为多异倍体细胞。
5、DNA倍体异质性分析
（1） 基本概念：肿瘤DNA倍体异质性，是指在恶
性肿瘤的不同部位组织中，DNA克隆
干系分布明显不同者，存在DNA倍体异质性，该肿瘤为DNA异
质体肿瘤；肿瘤不同部位
组织的DNA克隆干系相同者，则为DNA同质体肿瘤。当然，DNA倍体异质
性分析也适用
于对肿瘤原发灶和浸润灶、肿瘤原发灶和转移灶、肿瘤原发灶和复发灶之间DNA倍体的关
系分析，即DNA倍体异质性分析。
（2） DNA倍体克隆干系的判断标准：在不同肿瘤组
织中，在细胞DNA直方图上，原则
上其异倍体G01期细胞DI值之差≧0.2以上时，或DI值之差
虽然不大于0.2,但可分为明显
2个细胞峰者,均为不同克隆细胞；其DI值之差小于0.2时，则为
同一克隆细胞。DNA倍体
同质体包括：DNA二倍体同质体肿瘤，DNA近二倍体同质体肿瘤，DNA
四倍体同质体肿
瘤，DNA非整倍体肿瘤和DNA多异倍体同质体肿瘤。而DNA异质体肿瘤则包括：D
NA
二倍体与各种DNA异倍体的组合或各种异倍体类型之间的组合。
（3） DNA倍体异
质性分析的临床意义：DNA倍体异质性是恶性肿瘤的的重要生物学特性
之一。如果患者是DNA异质性
肿瘤，这表明它是多克隆起源的、肿瘤恶性度更高；而且在
肿瘤治疗时，增加了治疗的难度和复杂性；在
肿瘤预后上，增加了肿瘤的危险性。
6、细胞动力学分析方法进展
（1） 第
1代细胞周期分析方法：DNA合成与有丝分裂来确定细胞周期的时相和细胞动力
学——采用同步化细胞
氚标记胸腺嘧啶核苷掺入法，通过放射自显影技术，分析DNA合成
期及各时相时间。
（2）
第2代细胞周期分析方法：利用细胞G
01
、S和G
2
M期细胞核糖核酸含量
（DNA和
RNA）分布不同的的特征性差异，检测非同步化的活性大分子含量的变化——以DNA或<
br>DNARNA荧光探针染色，用流式细胞术检测细胞周期各时相细胞比例。后来以BrdU、
PC
NA、Ki67等方法标记进入细胞增殖细胞的方法——便于细胞复制与分期分析。
（3）
第3代细胞周期分析方法：细胞周期分子调控制机理 （细胞周期检测点等）、多元
化的细胞周期归宿
（如静止、分化、凋亡、增殖）联系在一起。近年，一些细胞周期调控基
因产物的发现（包括：CDKs
、Cyclins、CKls,等）。细胞周期的新理论与新技术包括：
① 突破经典的以DNA合成
、有丝分裂为标志的细胞周期分析模式，转向以时相性驱
动分子机制为基础的细胞周期分析（Cycli
n E+A技术）；
② 细胞周期检测点的分析（Cyclin域值技术）；
③
真正意义上的细胞增殖分析（双Cyclins 技术）；
④
细胞周期时相性细胞凋亡的分析（PA技术）；
⑤
细胞增殖与细胞凋亡同步分析（即调亡增殖比率分析）（CyclinSub-G
1
技术）
⑥ 非时相性Cyclins分析（双光源三参数Cyclin分析技术，分选后Westerm
Blot 技术
）。
新一代细胞周期分析理论与方法为细胞生物学、肿瘤细胞生物学、新药研究提供新技
术平台；又揭示了生物学里更深的科学问题。
34
第五节 细胞凋亡的检测和分析
细胞凋亡（apoptosis，Apo），又称细胞程序性死亡（programmed cell
death ,PCD），是
指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过
程。它是一个主
动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程（见图2-5-1）。细胞凋亡是
生物体中
一种普遍存在的现象。胚胎形成、衰老和损伤细胞细胞的清除、自身反应性T淋巴细胞的
清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。另外在干细胞最终分化成成熟的血
细胞的一系
列过程中，并非每个细胞都能够走到终点，相当一部分细胞甚至绝大部分细胞都
会在中途凋亡；胸腺的T
细胞95％存活不到成熟T细胞阶段；相当数量的原始和幼稚红细
胞在骨髓中发生“原位溶血”；这些生
理或病理过程都与细胞凋亡密切相关。
在细胞凋亡过程中细胞形态学的变化
在细胞坏死过程中细胞形态学的变化
图4-8-55
细胞坏死和细胞凋亡的形态学比较
细胞凋亡在形态和生化上有其明显的特征。在
形态上，早期细胞核固缩、染色体边集在
核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞
体积变小；细胞膜皱折、卷
曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏。最明显的特征是Ca
2+<
br>与Mg
2+
依赖的骨源性核酸酶
的激活，使细胞核染色体从核小体间断裂，形成
由大约为180～200bp或其多聚体组成的寡
核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳上形成特征性的“梯状带
”。 凋亡细胞形态上的改变影响它们
的光散射特性。在流式细胞仪上，前向角散射光与细胞大小有关，
而侧向角散射光反映的是
35
光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有
关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，
故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一
。
图2-5-1 细胞凋亡调控示意图
此外，细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细
胞侧
向角散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前向角散射光增大；侧向角散射光在细
胞坏死时也增大，因此可根据前向角散射光和侧向角散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需
要注意的是，
根据前向角散射光和侧向角散射光判断凋亡细胞的可靠性,将受被检测细胞形
态上的均一性和核胞浆比率
影响较大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡
的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其
可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主
要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分
析结合起来，用以区别经这些特殊处
理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
检测细胞凋亡的方法很多，常见的有电镜或光镜下的形态观察、细胞DNA提取物的
DNA L
adder电泳实验、细胞核小体相关DNA片段的检测等。根据细胞凋亡过程中的时相
变化，流式细胞
术用于细胞凋亡检测的方法主要有如下几种：
1、早早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）
Caspases-3又称半胱氨酸蛋白酶3，是细胞凋亡信号传导通路中的ICE蛋白酶家族的重
3
6
要成员，在细胞凋亡发生的早期被激活。ICE家族主要通过两种途径来引起细胞凋亡
的发生：
① 细胞毒T细胞（CTL）活化后大量表达Fas配体(Fas L)，Fas
L和靶细胞表面的Fas结合，
通过Fas分子胞内段的死亡结构域，激活Caspase 8，再激活
一系列Caspases，引起死亡信
号的逐级转导，最终激活内源性DNA内切酶，使核小体断裂，并
导致细胞结构毁损，细胞
凋亡。② CTL细胞颗粒胞吐释放颗粒酶，可借助穿孔素构筑的小孔穿越细胞
膜，激活另一
个caspases10,
引起caspases级联反应，使靶细胞凋亡。不管是由Caspase 8还是由caspase
10
启动的caspases 级联反应，都要经过caspase
3而向下逐级级联。因此，临床常用caspase 3
来检测早早期的细胞凋亡。
图4-8-16 细胞凋亡信号传递系统示意图
2、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：Annexin V-FITCPI法：
正常细胞膜磷
脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，
PS），而膜外表面含有占绝大多
数的中性磷脂。在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞
37
膜内部的磷脂
酰丝氨酸（PS）迁移到细胞外层表面，巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面
细胞的磷脂酰丝氨酸将凋亡
细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症
反应。 Annexin V 是一种对
Ca
2+
依赖，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针
识别细胞膜表面是否
有PS，从而识别凋亡细胞。由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷
脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始
阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。凋亡细胞对
所有用于细胞活性鉴定的染料（如PI）有拒染
性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞
DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细
胞则不会有红色荧光产生。因此，
在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此
相似。在流式细胞术
双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin
V-PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死
细胞，为Annexin V
+PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V +PI-。
图2-5-2 细胞凋亡的Annexin V-FITCPI检测法
3、晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：TUNEL法
TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TdT mediated X-dUP nick
ending end labeling,
TUNEL）是1992年Gavricli等首先报道
，它实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方
法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色
，能准确的反应细胞凋亡最典型的生
物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养
细胞和从组织中分离的
细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物
化学测定
法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双
链DNA会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列
3'-OH的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末
端转移酶（terminal deoxynucleotidyl tranferase,
TdT
）能够催化外源性荧光素或酶标记的dUTP连接到DNA的3'-OH末端，用流式细胞术
检测。该方
法首先采用蛋白酶K消化法或渗透法对标本细胞进行打孔，后将标本与TdT和
FITC及Biotin
标记的dUTP一起温育，在温育过程中，TdT将荧光素或生物素标记的dUTP
连接到DNA片断的
自由3’-末端上，采用生物素标记时可在荧光显微镜下直接对荧光素标
记的DNA片断进行观察；采用
生物素标记时，需以亲合素生物素-辣根过氧化物酶或亲合
素碱性磷酸酶系统显色后分析。亦可采用偶联
于碱性磷酸酶分子的抗荧光素抗体或连接于
过氧化物酶分子的抗荧光素抗体作为检测试剂。
近来的研究证实，Br-dUTP比生物素荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物、地高辛更
容
易掺入到凋亡细胞的DNA中（图2-5-3）。因为Br-dUTP有很强的掺入能力，所以在用荧光
38
素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时，会得到更好的流式细胞信号。未凋亡的细
胞因为没有
暴露的3’未端，所以不会被检测。
图2-5-3 TUNEL法检测细胞凋亡原理图
4、晚晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA含量分析法：
细胞凋亡时在细胞、
亚细胞和分子水平上所发生一系列特征性改变，包括细胞核的改变、
细胞器的改变、细胞膜成分的改变和
细胞形态的改变等。1991年许多实验室独立报道了，
由于核的改变造成各种荧光染料对凋亡细胞的D
NA可染性发生改变。
细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致DNA广泛断裂，这是细胞凋亡的特征性表
现，也
为FCM鉴别细胞凋亡奠定了物质基础。目前检测凋亡细胞DNA断裂的方法中，最常用、
最简便的就是DNA含量分析。细胞在染色之前，首先经去污剂处理，使细胞通透性增加，
或者用沉淀
固定剂进行固定。由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，使降解的DNA不
能完全封闭于细胞中，在
细胞洗染过程中DNA碎片从细胞内逸出。因此，凋亡细胞DNA
含量减少；加之由于DNA的降解，与
荧光染料的结合减少，故细胞DNA荧光强度降低；
DNA直方图上显示在G
01
峰前
出现一个DNA含量减少的亚二倍体或称亚G
01
峰，又称凋
亡细胞峰（见图2-5-
4）。
图2-5-4 细胞周期法检测细胞凋亡原理图
通过FCM测定DNA的含量，亦可同时分析凋亡细胞的周期位置，故FCM测定DNA含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。Andreff等用FCM研究细胞凋亡与细胞周期的关系
后提出凋亡分两个阶段：早期凋亡（early
apoptosis）即发生于药物作用于特定的周期时相的
细胞凋亡（homo-phase
apoptosis）多在作用后3～8小时内。而延迟凋亡（delayed apoptosis）
39
是指发生于同一周期的细胞凋亡（homocycle
apoptosis），或发生在分裂期后即子代细胞或称
为分裂后细胞凋亡（post
mitotic apoptosis）。他们指出：化疗药物对细胞作用是药物浓度和
作用时间依赖性
的，可分为四个阶段：（1）亚细胞阻滞阶段时DNA迅速修复，细胞存活，
并具克隆性，随后可发生细
胞分化，子代细胞的基因突变；（2）DNA损伤，干扰细胞周期
阶段或者DNA损伤后再修复，可导致
子代细胞的突变或发生延迟凋亡；（3）药物浓度的进
一步加大则可导致早期凋亡和延迟凋亡；（4）更
大剂量则造成细胞坏死。另外，应用FCM
方法，通过对DNA和RNA的联合检测，可以鉴别出G0
期细胞。因此，可分析细胞凋亡与
G
1
或G
0
期细胞
的关系。FCM对DNA含量的测定直观、简便、迅速、实用，是FCM判断
细胞凋亡的基本方法。 <
br>DNA降解的程度取决于细胞凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因素的特性。另外，
染色过程中
DNA逸出量的变化也影响FCM检测结果。据研究，将高浓度的磷酸-
枸橼酸缓
冲液（phosphate-citrate
buffer，PCB）较Hank`s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solut
ion，
HBSS）更易使凋亡小体析出，即将PCB加入漂洗液中，可增高降解DNA的逸出量，使亚
峰G
01
峰更为清晰，从而提高FCM区别凋亡细胞与正常细胞的能力。
D
NA含量测定在检测的细胞凋亡过程中的局限性在于其特异性不很高，因为：（1）亚
（2）亚G
01
峰并
G
01
峰的细胞数目只代表了核碎片的数目，并不代表凋亡细胞的
细胞数目；
非凋亡细胞所特有，非整倍体细胞、机械损伤细胞均可造成亚G
01
峰。因
此，FCM DNA含
量检测方法进行凋亡细胞分析时应注意结合其它形态学、免疫学或生物学方法或死
活细胞计
数、标准二倍体、免疫标志等参数进行综合分析，以更为准确地分析凋亡细胞状态。凋亡细胞DNA被降解，小分子DNA可以经通透细胞膜逸出细胞外，凋亡小体可带走一部分DNA，
因而
凋亡细胞DNA含量下降，由此导致DNA染料的染色能力下降，在G
01
峰前呈现亚二
倍体细胞峰，称为Apo峰。
5、细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测：
（1）FasFasL(Fas配体)：Fas抗原与Fas配体的交联是淋巴细胞诱导靶细胞凋亡的必需途径，
它们的异常与免疫相关疾病、肿瘤、移植排斥、病毒性肝炎、肾小球肾炎等多种疾病高
度相关。
（2）p53：p53是细胞周期中的‘检查点’分子，其控制着细胞在DNA损伤无法修复时启
动细胞的‘自杀’进程。p53的缺失或突变已被证明是多种肿瘤（如：乳腺癌、胃肠道
肿瘤
及肝细胞癌等）发生的重要原因。其表达高低是肿瘤诊断和预后的重要指标。
（3）Bcl-2：Bc
l-2是细胞凋亡的抑制蛋白，其与肿瘤的发生、发展和治疗等有着密切关系。
其表达上调是肿瘤诊断的
指标和预后的参考。
第六节 血小板及血小板活化的FCM分析
流式细胞术是血小板分析研究最好的方法，该法可提高检测灵敏度、并减少人为因素的
干扰，该法可以精
确地检测病人血小板生成方面的情况，即使血小板计数很低时也可检测表
面标记。
一、血小板表面标记检测方法
全血法荧光单标记可检测血小板CD62p、CD63、C
D42b、CD41、CD61等指标。具体
染色方法步骤如下：
1、
采血用枸橼酸盐或EDTA抗凝；
2、10μl荧光标记抗体，加100μl
PBS，再加5μl全血（样品管）；
10μl抗体同型对照，加100μl
PBS，再加5μl全血（对照管）；
40
轻轻混匀，室温孵育15min；
3、加2-3ml PBS（1%
PFA）终止反应，上机检测分析。
二、流式细胞术计数网织血小板(RP)：
血小板RNA含量与血小板生成状态相关，他可以区分是因为骨髓抑制或外周破坏增加引
起的血
小板减少。在化疗后或移植后，网织血小板可以监测巨核细胞和血小板生成状态。
（1）网织血小板检测原理：
噻唑橙（thiazol orange，TO）是一种亲脂性
的荧光染料，能迅速通过活细胞膜，与
RNA结合后，荧光强度提高3000倍，利用TO这一性质很多
学者建立了流式细胞仪检测网织
血小板百分率的方法，但尚无统一的标准方法。
（2）网织血小板检测方法：
① 制备富含血小板血浆：将EDTA抗凝全血500
rpm离心8min，取出上层含血小板血
浆，2000 rpm离心10min，弃上清液，底层血小
板用柠檬酸钠葡萄糖EDTA缓冲液（pH7.4）
再悬浮，并洗一次，再用Tyrode's缓冲液（
含牛血清白蛋白和EDTA）洗两次，再悬浮在Tyrode's
缓冲液中，调整血小板浓度为100×
10
9
L作为样品。
② 醛化固定:向标本加入1%甲醛，在4℃放置2h以上，以
固定血小板。检测前用Tyrode's
缓冲液洗一次。
③ 染色计数：向50μl经过醛化
固定的血小板悬液加450μl噻唑橙染液，放室温暗处
1～2h，用流式细胞仪测定525nm波长处
的荧光强度，代表RP数量。同时计数血小板总数，
计算得知RP的比值。这即RP的半自动计数法。因
为该法采用噻唑橙染色，被染色的血小
板又称为噻唑橙阳性血小板（TO+血小板）。
（3）网织血小板检测的临床意义
① 用RP的相对百分率反映外周血中血小板的更新状态
② 血小板减少症时的RP百分率均明显增加： ITP、肝脏疾病、
③ 健康新生儿的RP
与孕龄有关，孕龄<30周的新生儿RP明显高于>36周新生儿RP
和30～36周的新生儿RP。
④ 作为骨髓抑制后血小板的恢复和造血促进因子使用后血小板造血的监控指标，网织
血小板可
以作为临床应用血小板生成素效果的评价指标。
⑤
用于造血干细胞移植和化疗后造血功能恢复的估计，可作为骨髓造血重建和使用血
小板生成素的指征。
三、流式细胞术检测血小板相关抗体（PA-IgG）：
是由一种能够通过胎盘、存在于血小板表面的免疫球蛋白，称为血小板相关抗体
（PA-
IgG）。PA-IgG包括3种成分：（1）真正的抗血小板抗体。（2）循环免疫复合物。（3）
非
特异性吸附于血小板表面的血浆免疫球蛋白。已经确认，PA-
IgG和原发性血小板减少性
紫癜（idiopathic thrombocytopenic
purpura，ITP）及其它免疫性血小板破坏疾病相关。与血
小板结合的PA-IgG
数量检测结果，可以作为临床诊断依据，比其它单一检测方法更有价值。
（1）试剂
洗涤缓冲液（PBSEDTABSA）：PBS缓冲液，含10mM EDTA和0.5% BSA。
抗体：Goat F（ab
）
2
Anti-Human
IgG（Fc Sp.）—R-PE （H10104，Caltag.
为多克隆抗体）
阴性对照：Goat
F（ab
）
2
IgG—PE（11304，Caltag）
（2）样本
① 正常人血样:1个，血小板数值在正常范围，具体数目不详。
②
病人血样：2个，为一月龄的双胞胎（患者1和患者2），均为贫血血小板，具体数目
41
不详。
（3）步骤
①
用含EDTA抗凝剂的血液收集管采血，三个血样均取2ml分别加到三只流式标准管中。
②
离心500 rpm 15min，将上清（富血小板血浆）转到另外三只流式标准管中。
③
离心2500 rpm
3min。吸去血浆，用与血浆等体积的洗涤缓冲液重悬血小板。如果必
要，可用旋涡混合器混匀。
④ 洗涤缓冲液洗涤血小板三次，每次离心2500 rpm 3min。
⑤ 适量洗涤缓冲
液重悬血小板，用血球计数仪测定血小板的浓度，其中正常血样血小板
数为2000µl，患者
1的血小板数为6000µl，患者2的血小板数为7000µl（稀释浓度）。
⑥ 每个含重悬血
小板的流式标准管分成两管，A管为检测管，B管为阴性对照管，共6
只管。正常人血样分别取250µ
l于两只流式标准管（A管和B管）中，每管血小板总数为5
5
×10
。患者
1血样分别取80µl于两只流式标准管（A管和B管）中，每管血小板总数为
5
4.8×10
。患者2血样分别取70µl于两只流式标准管（A管和B管）中，每管血小板总数为
5
4.9×10
。
，
⑦ 将上述六只流式标准管，于A管均加5µl
Goat F（ab
）
:
Anti-Human IgG（Fc
Sp.）
B管均加5µl Goat F（ab
）
2
IgG。
⑧ 室温，避光孵育15min。用洗涤缓冲液再洗一次，方法同步骤4。
⑨去上清，加0.5ml洗涤缓冲液重悬，上机分析。结果见图2-2-4。
阴性对照样品
正常人样品
42
患者样品
图2-6-1 血小板抗体的检测结果
（患者样品散点图的细胞群和直方图的峰均显著右移）
四、全血中活化血小板检测：
活化血小板表面会出现一些新的标记。主要的有两个：PAC-1 （活化的 IIbIIIa）和
CD62P （P-selectin）， 它们是对临床有用的活化血小板标记。此外还有CD31
（PECAM）
和 CD63 （a lysosomal
antigen）两个活化标记，并已在临床应用。血小板活化研究的全
血标本收集要求使用 19号（
或更大）针头，开始吸出的2ml血注入试管（或弃用），然后
将后续血液轻轻注入另1个试管。
（1）血小板特异性膜糖蛋白检测 先对全血中的血小板膜糖蛋白进行免疫荧光标记，将血
小
板与血中其他细胞分开。根据血小板特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地
识别血小板。
（2）活化血小板的标志物检测 活化血小板与静止血小板相比，膜上某些糖蛋白常发生显
著
变化，成为活化血小板的检测标志物，如CD62P和PAC-1等。应用这些特异性糖蛋白制
备的荧光
单抗，便能在全血中特异性地识别活化的血小板，血小板膜糖蛋白已被深入研究，
表2-6-1显示了血
小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面
表达主要有GPIb，GPII
b，GPIIIa等有限的几种。
表2-6-1 活化血小板CD单抗简介
CD单抗 代表性单抗 识别的膜糖蛋白
CD36 5F1，CIMeg1，ESIVC7
GPIV
CD41 PAC1，7E3，PBM6.4 GPIIbIIIa和GPIIb
CD42a FMC25，BL-H6，GR-P GPI
CD42b
PHN89，AN51，GN287 GPI
CD61 Y215，CLB-thromb1
GPIIIa
CD62 CLB-thromb6，RUU-SP1.18.1
P-selectin或GMP140
CD63 RUU-SP2.28，CLB-gran12
GP53
（3）全血法双标记检测活化血小板的染色方法：如CD62p-FITCCD42b-PE
① 采血枸橼酸盐或水蛭素抗凝；
② 10μl CD62p-FITC加10μl
CD42b-PE,再加5μl全血（样本管）；
；
10μl
IgG
1
-FITC加10μl
IgG
1
-PE,再加5μl全血（对照管）
轻轻混匀，室温孵育15min；
③加2-3 ml PBS（1% PFA）终止反应，上机以SSC-
LOGCD42b-PE圈定血小板检测分
析
五、流式细胞术检测血小板的注意事项：
（1） 抗体的选择：选择CD workshop
中的单克隆抗体。因为单克隆抗体反应特异性高，
非特异性结合少。但由于血小板富含Fc RⅡ(CD
32,FcⅡ受体)，而Fc受体对不同抗体亚类具
有不同亲合力，所以在亚类选择上，对于人的抗体以
选择IgG1为好。
（2） 抗凝剂的选择：肝素尽量避免用；EDTA在室温20-25℃时其抗凝
效果与枸椽酸盐无
差别，但在37℃时，EDTA就会影响蛋白结构及剌激血小板活化。
43
（3） 标本的采集：一般采少量外周血，收集在玻璃容器或塑料容器中，采血中避
免组织
液流入血液中；防止气泡产生；并使用大号针头（如18号）。尽量减少化学、物理的激活因素对血小板的活化作用。标本的放置温度以15-25℃为宜，4-10℃以下血小板的外形发生改
变。
（4） 抗体标记物的选择：我们知道，FITC和PE标记是最常用的在488nm激发下作为
双标记使用的试剂，PE的荧光强度比FITC强。因为在用单色测定中CD62p和CD63在静止血小板上均为弱表达，检测这两个抗原时用PE标记为宜。而当CD62P和CD63配合一个
高
强度表达的抗原CD41、CD61
或CD42b作为双标记时，CD62p和CD63却宜使用FITC
标记。
（5）样品固定
：先固定样品可减少血小板的体外活化，但先固定可能破坏一些蛋白质结
构，增加非特异染色；因此，除
作体外剌激血小板活化研究和不能及时处理标本外，均应先
标记后固定。固定剂使用0.5-1.0%的
多聚甲醛。
（6） 缓冲液：PBS（0.01M,pH7.2）+BSA在孵育和洗涤过程中为首选
。但当在分析血小
板活化过程中洗涤时，宜用Tyrodes缓冲液，因为该缓冲液中含有Mg
++
和葡萄糖，可能减
少血小板的体外活化。
（7）仪器的设置：首先利用微球进行
仪器光路和光电信号的控制，使仪器保持一个稳定、
灵敏的状态。数据采集后，散射光和荧光均使用对数
放大，调节散射光电压，使细胞群分布
在中央。调节荧光电压，使样品继发荧光强度落在对数值1内，荧
光补尝可用荧光微球或用
双色标记单抗做（如CD4-FITCCD8-PE）。标本至少分析5000
个细胞，而且最大流速不宜
超过1000-1500个细胞s。
（8）数据分析：在活化血小板（CD62p、CD63）等少量表达抗原的检测中，阈值的设定 一般是使非特异性染色的比例控制在1-2%的范围内，但要对非特异性染色进行正确的设定
依靠仪
器的敏感度及试剂的质量。当测定的抗原本身为高表达时，要判断抗原表达的高低度
时，需要依据平均荧
光强度为宜。
第七节 造血干细胞（CD34+细胞）的检测
外周
血现已广泛地被用作骨髓移植、癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建所需血
干细胞（Hemoto
poietic Progenitor Cells HPC）的来源。外周血源性干细胞现主要被运用自体<
br>移植，其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。使用外周血替代骨髓作为造血干细胞的来
源有着
以下优点：易采集、对供者无需全身麻醉、减少了采集后并发症的发生、受者造血系
统重建快、费用低及
住院时间缩短或可部分或全部在门诊完成操作等。发现CD34抗体可鉴
别造血干细胞，并成功地应用流
式细胞仪定量检测造血干细胞。正常人外周血中干细胞数量
只占所有有核细胞的0.1%。自从发现、纯
化、标记抗CD34单克隆抗体开始，使流式细胞
定量检测在外周血或骨髓中的CD34阳性造血干细胞
成为了可能。CD34抗原存在于各种祖
细胞上，其中包括多能干细胞和间质干细胞。在某些组织的上皮
细胞上也有表达。CD34阳
性细胞运用SSC与CD34双参数流式散点图来检测。证实CD34+细
胞计数是决定干细胞采
集时间的有效方法。使流式细胞仪定量检测CD34+细胞成为监测动员干细胞和
计数移植中
造血干细胞数量的有效和精确的工具。有工作发现CD34+CD33+双阳性细胞数量与早
期移
植成功有相关性。同时又注意到骨髓中提取的CD34+CD38-阴性的细胞在IL-3，IL-
6和
GM-CSF刺激下能够形成最原始的集落；随着CD38抗原的增加，CD34阳性细胞形成这种
原始集落的能力下降。在CD34+细胞中，CD34+CD38-表型的细胞占1.0%左右。随后又
发
现了其他细胞表面抗原在识别多能干细胞中起重要作用。对于绝大多数临床应用来说，计数
C
D34+细胞已足够为移植提供可靠、持久的参数。
44
计数CD34+细
胞主要有Milan方案、ISHAGE方案及ProCOUNT方案，前两者均为双平台，
后者为单平
台。所谓双平台法是指先用流式细胞术检测待测样本中CD34+细胞的百分比，再
用血细胞计数仪测定
样本白细胞总数，两者乘积为样本中CD34+细胞总数，这样的方法结果
可能来源的误差有两个，即流
式细胞仪的误差和血细胞计数仪的误差。单平台法是指同时测
得CD34+细胞的百分比及绝对数的方法
。ProCOUNT方案是用事先加入已知数量的荧光微球，
以此作为内参，换算出CD34+细胞的绝
对数，这样能对CD34+细胞进行精确计数，缺点是成
本较高。流式细胞仪计数CD34+细胞百分比
和绝对数量的方法存在较大的变异性,其原因在
于:(1) 不同的分析方法导致结果误差。一些小组已
经尝试把方法标准化,如单色分析的
Milan方案和双色分析的ISHAGE方案。但这些方法亦非尽
善尽美。Milan方案由于只使用
CD34-PE单色分析,不能有效排除非特异染色造成的干扰；而
ISHAGE方案的数据处理中忽略
了CD45dim-的造血干细胞。ProCOUNT方法结果均低
于以往ISHAGE等方案的测定数值,主要
是因为采用了核酸染料、CD34-PE和CD45-Pr
eCP三种试剂染色并进行多色分析,精确确认了
造血干细胞,充分排除了非特异染色、细胞碎片及血小
板的干扰。(2) 传统的流式细胞仪造
血干细胞计数采用的是双平台方法，研究表明双平台绝对计数法
在不同实验室间的变异性很
大,这种变异可能是由于不同血细胞计数仪的误差所致。(3) 在造血干细
胞计数时,多采用溶
血洗涤法,常导致样本处理过程中细胞损失,也在一定程度上影响了实验结果的准确
性。
图2-7-1 健康中国成年人外周血CD34+造血干细胞绝对计数参考范围
一、CD34检测方案标准化
1、“米兰”方案
第一个广泛应用的干细胞计数方案是由Istituto
Nazionale Tumori in Milan的Siena等人
创立的米兰方案（Milan
Protocol）。在此方案中，需准备3管50 ul的血样或leukapheresis
样本（
如白细胞计数小于150ul，如受者样本，则样本和抗体均需加倍）；其中1管留出不
作染色，1管加
入15ul的抗CD34和CD33抗体，第3管则加入15ul的抗CD2CD19抗体
（计数T、B
细胞）。细胞在4℃下避光孵育25分钟，之后加入红细胞溶解液。孵育15分
钟后加入不含钙、镁离子
的PBS洗液，1500 rpm 离心7分钟洗涤，如果红细胞溶解不彻底
则可重复溶解过程。弃上清
后细胞可在4℃保存并于一小时内上机检测。在光散射参数中分
析所有细胞，设“门”选定所有白细胞（
排除碎片），并设立一“门”C信号和CD34阳性
表达加以区分。CD34弱阳性细胞一般不分析。见
图2-7-1。
目前有很多“米兰”方案的改进版，分别从：运用不同的CD34抗体、不同的溶血技
术、
加入其他抗体来提高鉴别力、变换荧光标记、使用CD45抗体或其他核酸染料来更方便地鉴
别白细胞等方面进行改进。
45
散射光图
同型对照 CD34+细胞检测
图2-7-1
米兰方案检测外周血的CD34+细胞
2、ISHAGE方案
Sutherla
nd于1994年在它的研究使用与以方案相似的手段分析，随后此方案被ISHAGE
收录作为推荐方
案使用，旨在确立一个普遍通用的、可排除实验室中或实验室间差异的方案。
这个方法是由“门”不断累
加来完成的。第一个“门”是基于CD45SSC双参数图上的；通
过对其设“门”可去除红细胞、碎片
、和聚集物，这些干扰在造血细胞样本中尤为多见，特
别是在样本使用溶血-免洗法处理后。通过此步骤
也为以后计算CD34阳性细胞比例提供了
可靠的分母（总白细胞数量）。在R1“门”中，最少要包括
75 000个细胞，并在R4“门”
要计数超过100个CD34阳性细胞。
图2-2-8
CD34+细胞的检测（D、E、F、G为实验样品；H、I、J为对照样品）
（D、E、F、G为实验管；H、I、J为同型对照）
46
（
）
图2-7-2 ISHAGE方案CD34+细胞检测结果
将通
过R1“门”获取的细胞显示在CD34SSC双参数散点图，在此图中设立R2“门”
并调节其位置包
含所有CD34强阳性或弱阳性的并SSC信号弱及中等的细胞。建立一
CD45SSC双参数散点图，
将以上CD34+细胞显示于其中；在其中设R3“门”去除CD34+
颗粒中的聚集血小板、淋巴细胞
和单核细胞。将R3“门”中圈定的细胞显示在FSCSSC图
中以检测细胞是否落在平时的幼稚淋巴细
胞“门”R4中，通过R4要去除比淋巴细胞小的
颗粒。（注：如何确定R4“门“的位置呢？方法如下
：在CD45SSC双参数散点图中设立
R5“门”圈定CD45强阳性且SSC低信号的淋巴细胞群体
，将R5“门”中的细胞显示在
R4“门”所在的FSCSSC双参数直方图中，根据其中的淋巴细胞的
位置调节R4“门”，确
定R4“门”在FSC和SSC轴上最小值的最低范围。）在脐血标本中，会出
现CD45CD34
双阳性的血小板集聚颗粒，但它们的侧向角散射光弱于真正的CD34+细胞，可被
处于幼稚
淋巴细胞位置的R4“门”排除。最终在R4“门”中读取CD34+干细胞计数的数值。此时
如检测CD45ISOTYPE双染的阴性对照，在ISHAGE方案设门分析，在R4“门”中几乎不
见非特异性染色颗粒存在。如在某些情况下R4出现非特异性染色颗粒，则在样本计数时要
从R
4“门”减去非特异性染色的细胞数。
对于此方案有一争论，是否所有CD34特异性染色的颗粒CD
45
都是弱表达。为了解决
此疑问，在仪器调节和设“门”方面又作了改进，两个独立的直方图
被加入上述的四图型方
案中。在第1个直方图中增设R5“门”来精确圈定淋巴细胞：CD45强阳性且
SSC低信号。
并将这些细胞显示在第6个FSCSSC双参数直方图中。据此可确定R4“门”的圈定
幼稚淋
巴细胞最小范围（第4个直方图为第6张的拷贝）。这样就能最大限度地去除血小板、未溶
解的红细胞、和其他碎片。这张直方图还可以确定FSC的预值设置是否适当，FSC和SSC
的电压
设置是否足够。因为在此图中要确保CD45阳性的最小淋巴细胞能够适当地在
FSCSSC图中显示出
来。建议最小淋巴细胞的FSC参数强度在1024线性坐标上，位于200
左右的位置上。当FSCS
SC的电压及阈值都设置完毕后，调整第1直方图中R1“门”的位
置，使其包括所有CD45弱阳性和
阳性颗粒。R1“门”在CD45坐标的下限，则根据以下直
方图来确认：建立第5张CD45CD34
双参数直方图，根据CD34阳性颗粒的CD45表达的
最小值建立十字门，确保所有CD34阳性CD
45极弱表达的细胞全部在CD45设定界线的左
侧；然后根据此图的CD45界线位置确定R1“门”
的最小值。
CD34+细胞百分比检测可通过对白细胞决对计数转换成CD34+细胞绝对计数。在原
有
的ISHAGE方案基础上，在第三或第四荧光通道中检测已知数量的标准微球便能达成以上
目的。这样就能使无法定量的单平台流式细胞仪变为能直接绝对计数干细胞的精确仪器。
ISHAGE方
案完全兼容使用7-AAD荧光染料进行样品活性检测，这样就能在样本中绝对定
量计数有活性的CD3
4+阳性细胞。这一点对临床上在检测抽取时间过长的样本时十分有意
义。
47
三、ProCOUNT分析CD34细胞的方法
ProCOU
NT是三色直接荧光标记快速计数CD34+细胞的自动计数系统，它包括
ProCOUNT试剂盒与P
roCOUNT自动获取分析软件。
1、ProCOUNT原理及方法：
软件先
获取5μΙ样本，用此数据在FL1（核酸染料）-SSC设一个实时的“门”，去
除碎片，并在此界限
设定阈值，此“门”亦用于对照管，故对照管在实验报告图上无显示。
然后软件获取1000个微球，再
按选定的收获界限收获细胞。
由于CD34+细胞相对含量较低，流式细胞学上的特征与其它细胞群体亦有相似之外 ，
所以
需要一个利用已知祖细胞特征的多参数设“门”策略，通过“门”的集合或逻辑“门”
来有效地除外如粒
细胞、单核细胞、碎片等不需要的细胞群体。这种分析方法利用细胞颗粒
度（SSC）、核酸染料表达（
FL1）、CD45表达（FL3）和CD34抗原表达（FL2）的特点
帮助区分祖细胞与其它细胞群
体。图2-7-3为ProCOUNT试剂盒所有的多参数设“门”方法。
首先确认微球群体，因为CD
34细胞太少，需依与其它细胞群体关系设定CD45“门”：以
单核细胞群确定“门”SSC上限，以
10%低SSC粒子确定右限。此“门”去除CD45强阳
性细胞。单核细胞还用于FL2-FL3和F
L1-FL2散点图辨别CD34细胞群的分界。因碎片已
在获取是用全阈值去除，故所有非微球粒子均
被认为是有核细胞，CD45计数不包括CD45
阴性细胞。前两步（ ）通过核酸染料（
FL1）去除细胞碎片，除外所有CD45（FL3）
染色较强的细胞，从而确定祖细胞的位置。同时，
不属于祖细胞的高侧向角散射光（SSC）
细胞群体亦被排除在外。由此可在
FL1（核酸染料
）和FL2（CD34）的双参数散点图中清
楚地看到祖细胞和其它细胞群的区别。围绕祖细胞群体设门
，定量微粒可以完成绝对数的后
续步骤。
图2-7-3
ProCOUNT方法分析CD34+细胞
（绿色细胞群：非CD34细胞；红色细胞群：CD34+细胞；蓝色细胞群：绝对计数微球
2、ProCOUNT质控：
（1） CD34管与对照管有核细胞绝对计数差异≤21%对
照管有核细胞绝对计数（主要
是控制加样误差与试剂误差）；
（2）对照管CD34“门”中
最大细胞数（控制非特异染色）；对照管CD34“门”中最
大细胞数≤10%或≤4μΙ或≤5%CD
34管CD34细胞绝对数；
（3）CD45SSC“门”中%最低FSC的细胞去除后，CD34绝对数应显著改变；
（
4）CD45SSC门向下，向左，向右变小10道左右，CD34绝对数不应显著改变（检
验CD45
SSC门设定。
48
四、DNARNA染料CD34-PECD45-PC5+定量荧光微球检测 DNARNA染料在FL1中检测，用来识别所有有核细胞，在流式细胞仪分析时作为圈定
白细胞的
基础。采用标准ISHAGE方法进行CD34-PECD45-PC5染色分析，绝对定量微球
BD机
器在FL4通道内检测，Coulter机器可在FL3通道内检测。
1、样本准备
（1） 验证移液枪的准确性。可用去离子水作为标准品（吸取100ul的去离子水=1mg），吸取后放在精确的称量器称量以检测吸取量的准确性。通常新鲜的样本比较容易分析，固建
议样本保
存时间要小于48小时。冷冻保存的样本不推荐使用。标本需混匀但不可形成涡流。
（2）标本量的准
确吸取将关系到整个实验的精确性，因此要使用反向吸取法。使用移
液枪时，将吸样按钮
打二
档轻微地吸取微球，后将按钮推至第一档将微球排出，留下残余液体在枪头内弃用。由
于第一次吸样时，
Tip是干的，会导致部分样本粘附在管壁上；固建议在吸样时，先将Tip
头在样本中吹打几次后再吸
取样本。在每个检测试管中加入100ul的标本。
（3）在相应的试管中加入单克隆抗体。轻轻混匀
后室温下避光孵育10分钟。室温下加
入100ul Cal-LyseTM(Caltag code
#’s CAS010 and GAS-010S-100)；混匀后避光室温下孵
育10分钟；加入
1ml去离子水（室温下），混匀孵育5分钟。
（4） 在上机检测前，人工仔细将Perfect
Count微球混匀30~45秒钟（避免形成涡溜）。
使用相同的移液枪及加样方法在已溶血的样本管
中加入100ul的微球（微球量与样本量相同）。
（5）在上流式细胞仪检测前，将待测管附上盖膜充分混匀30秒后上机。
2、仪器设置
（1） 以下的程序是对于多色染色标本来调节仪器各项参数并建立相应的检测方案。
首先检测
未染色（含标准微球）的已溶血样本，用来设定前向角散射光（FSC）的阈值或敏
Perfect-C
ount微球能在FSCSSC
感度。检测微球无须对FSC和SSC探测器进行额外的调整。
双参
数散点图及在FL1，FL2，FL3和FL4中检测到。
（2）
在FSCSSC双参数散点图中设立一“门”，包含所有白细胞亚群和二群微球。
3、数据获取
为了取得精确的数据，至少要收集1000个以上微球，同时计数相应的细胞数。
4、结果分析
（1） 在FSCSSC双参数散点图中建立“门”A或R1圈定所有微球（A
，B两种），
如图2-7-4之左图。在FL2SSC双参数散点图中显示A或R1“门”中颗粒。如细
胞所染荧
光在FL2中对微球有干扰则可选用FL1、FL3或FL4荧光通道。新建“门”B或R2圈
定所
有微球，同时确保去除所有碎片。如图2-7-4之中图。
（2） 在FL2SSC双参
数散点图中显示B或R2“门”中的微球。新建“门”C或R3
和D或R4根据两种微球在FL2中不同
的荧光强度分别圈定微球A（FL2弱荧光）和微球B
（FL2强荧光），如图2-7-4
之右
图。
检查仪器的统计数据与微球说明书的参数是否一致。注明微球最后的计数数量。
49
图2-7-4
DNARNA染料CD34-PECD45-PC5+定量荧光微球检测造血干细胞
（3）建立新“门”圈定所要分析的细胞群体。注明所有分析细胞最后的计数数量。
（4）计算目标细胞的绝对数量，-可根据以下公式来计算细胞群体的绝对数量：
流式细胞仪细胞计数数量
细胞绝对数量（每微升细胞数）=
×流式细胞仪微球计数数量
已知每微升微球数量
五、CD34计数的质量控制：
在CD34计数检测中有众
多因素影响着计数的准确性。这些因素可通过以下操作步骤来
去除这些影响：①
尽量减少对样本处理步骤；② 使用适当标记的抗体；③ 选择适当的阴
性和阳性对照标本；④
收集足够的细胞数来降低变异系数；⑤ 采用标准设“门”和分析方
案。但以上任何一条都没有国际上通
用的标准，很清楚我们需要为CD34干细胞计数设立一
个广泛同意的标准来减少其中的变异性。现将一
些标准总结如下：
1、样本准备
Ficoll淋巴细胞提取液来富集单个核细
胞，经常会得出不精确的评估数据；单个核细胞
分离操作会导致外周血中26%的、骨髓中21%的、采
集品中5%的CD34+细胞丢失。现改用
对全血进行溶血来去除红细胞。
2、溶血剂
不同溶血剂都能使CD34阳性细胞明显地与阴性群体相区分
3、样本问题
血小板可能会与CD34+或CD34-细胞结合影响精确计数，因为聚集的
血小板可能会与
CD34、CD45抗体微弱结合，但可通过巧妙的设门方案将其去除
4、CD34
抗体的选择
不同荧光素标记的CD34抗体能与CD34抗原的I
、II、III类位点结合，CD34的不同抗
原位点可根据其对不同的蛋白水解酶的敏感性来区分。使
用III类位点特异性抗体能最大限
度地提高检测的敏感度。现普遍推广使用与III类位点结合的抗体
，这些抗体能有效地与多
种荧光素结合如：FITC、PE、PerCP、APC和PE-CY5。
5、阴性对照
如何选择一个恰当的阴性对照，一般选用同型免疫球蛋白作为非
特异性染色的本底。
但在CD34抗体染色的标本中，目标细胞群可能少于总细胞群的0.1%；而只有
目标细胞群
大于1%时才适合用同型作为阴性对照。另外，采用多参数设“门”技术来区分特异性结合<
br>群体，CD34+细胞同时也表达CD45；在CD45SSC双参数图中，CD34+细胞与淋巴、单核
、
粒细胞相分离独立成群。这个方案要检测样本中的极少数细胞群时显得格外重要。
6、阳性对照
在临床检测中需要检测阳性样本，据此来检查操作过程是否正确，并可作为质控。阳性
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