流式细胞分析技术及应用-WuhanUniversity
中秋节英文怎么说-辞职报告范本
流式细胞分析技术及应用
黄赞
第一节概述
一、工作原理
二、散射光的测定
三、荧光测量
四、细胞分选原理
第二节数据的显示与分析<
br>一、参数
二、数据显示方式
三、设门分析技术
第三节流式细胞仪免疫分析的技术
要求
一、免疫检测样品制备
二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色
三、流式细胞免
疫学技术的质量控制
四、应用
流式细胞术(flow cytometry,
FCM)是以流式细
胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
细胞理化特性进行多参数定量
分析和分选的新
技术。
参考书：
流式细胞术，陈朱波，曹雪涛，科学出版社2010年
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细
胞器或微
粒的结构及功能不被破坏的状态下，通
过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号
对细胞进
行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量、多参数、
高纯度
分选
流式细胞仪与显微镜的区别
区别
光源
对象
承载工
具
检测信号
放大方式
统计
结果
流式细胞仪
激光
细胞
、生物粒子
鞘液及流动室
光学信号
PMT、放大电路
计算机，>5000多参数，综合分析
显微镜
自然光、灯光、激光
细胞、组织等
载玻片
形态及染色
目镜×物镜、光学放大
人工，200
简单，少数参数
第一节概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光
强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和
分选基础上发展起来的对细胞的物理或化
学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、
蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类
收集的高技术。
流式细胞术发展史<
br>•1930 年，Caspersson 和Thorell
开始致力于细胞的计数
。
•1934 年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自
动
化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞。
•1936
年，Caspersson 等引入显微光度术。
•1940 年，Coons
提出用结合了荧光素的抗体去标记细
胞内的特定蛋白。
•1947 年，Guclcer
运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计
数器。
发展史
•1949
年，Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法
的专利。
•1950
年，Caspersson 用显微分光光度计的方法在UV
和
可见光光谱区检测细胞。
•1953 年，Croslannd-Taylor
应用分层鞘流原理，成功的
设计红细胞光学自动计数器。同年，Parker 和Horst 描
述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。
发展史
•1954
年，Beirne 和Hutcheon 发明光电粒子计数器
•1959 年，B 型Coulter
计数器
•1965 年，Kamemtsky
等提出两个设想，一是用分光光
度计定量细胞成分；二是结合测量值对细胞分类。
•1967
年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven
的方法的
基础上提出细胞分选的方法。
发展史
•1969 年，Van
Dilla，Fulwyler 及其同事们在Los
Alamos
，NM（即现在的National Flow Cytometry Resource
Labs
）发明第一台荧光检测细胞计。
•1972 年，Herzenberg 研制出一个
细胞分选器的改进型，
能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光
信号。
•
1975 年，Kohler 和Milstein 提出了单克隆抗体技术，为
细胞研究中大量的特异
的免疫试剂的应用奠定了基础。
发展史
•1973 年，BD
公司与美国斯坦福大学合作，研
制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪
FACS I。•从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式
细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展
的时
BD FACSCalibur<
/p>
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小
粒度
DNA
, RNA含量
蛋白质含量
PH值,
膜电位
钙离子
,
蛋白修饰
细胞功能
细胞表面胞浆核--特异性抗原<
br>细胞活性－细胞周期、凋亡
胞内细胞因子
激素结合位点
酶活性
<
br>一、工作原理
采用激光作为激发光源，好的单色性与激发效率；
荧
光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，灵敏
度和特异性；
用计算机系统对流动的
单细胞悬液中单个细胞的多
个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统
计分析精确性。
激光
流式细胞技术
发射光
前向散射
侧向散射
基本过程
已标记的单细
硅化管
胞悬液和鞘液
流动室
形
成稳态
单细胞液柱
喷嘴
水平激光与之
荧光染料被
垂直相交
放
大
激发发光
荧光检测系统和
散射光感受系统
收集光信号
光电倍增管<
br>脉冲信号
计算机系统
分析结果
基本工作原理
基本工作原理
主要技术指标
•测量灵敏度：单个微球上最少
标有FITC
或PE荧光分子数目表示
•分辨率：通常以变异系数CV表示
•前向角散
射光检测灵敏度：0.2－0.5微米
•分析速度：每秒可分析的细胞数
1.流
式细胞仪的基本结构：
（1）液流系统:
流动室和液流驱动系统
依次传送待测样本中的细胞到激光照射区
（2）光学系统: 激光光源光
束形成系统和
光路系统
细胞由激光激发,通过光学滤片
产生光信号,并传送到相应的探
测器
（3）数据处理系统:信号检测分析和存储显
示分析
把光信号转换为电信号
（1）液流系统
•由样本和鞘液组成
•待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记
的
单抗对其染色受清洁气体压力从样品管进
入流动室形成样本流
•鞘液：辅助样本流被
正常检测的基质液。主要作用是
包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心
位置，防止
其靠近孔壁而阻塞喷孔。
液流系统示意图
喷嘴
鞘液
荧光信号<
br>激光束
FCM的液流系统（如
何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换
言之，在特定
时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时，
一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想
角度，这
在一定程度下是允许的。
•高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本
流变宽，细胞间距离
缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快
速获取数
据。
•低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细
胞可流经激光束的中心，
细胞受激光照射的能量比较均一，因而低
流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
•为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操
作是至关重要的。
（2）光学系统
•激光光源：488nm气冷式氩离子激光器
•光束成形器：两十字交叉放
置的透镜
•分色反光镜：反射短波长，通过长波长
•透镜组：形成平行光，除去室内光
•滤片：长通、短通、带通
光学系统示意图
Flow
Tip
S
S and FL
Detector
FS
Detector
Laser
二向色性长通滤片(DICHROIC
FILTER)
一定波长以上的光通过，该波长以下的光被折射
。45
度角放置
带通滤片(BAND PASS)
允许一定波长的光通过
（3）数据处理系统
•主要由计算机及其软件组成
•光电倍增管：FS,
SS（散射光），
FL1, FL2, FL3,
FL4（荧光）
信号放大方式
经过PMT
将光学信号转变为电脉冲信
号，并增加PMT 的电压及增益，可将
脉冲信号进行放大。放大方
式有两种
：
通常前散射信号用线性放大，荧光信号用对数放大
<
br>二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时
向周围360°立体角方向散射的光线<
br>信号，它的强弱与细胞的大小、形
状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向
散射光。
前向散射光
（forward scatter, <
br>FS）：激光束照射细胞时，光
以相对轴较小角度
(0.5°～10°)
向前方
散射的讯号用于检测细
胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
选取FSC 作阈值，来排除样
品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，
以避免对被测细胞的干扰。
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射
细胞时，光以90°角散射的讯号，用
于检测细胞
内部结构属性。
侧向散射光示意图
Laser
FA
LS Sensor
90LS Sensor
侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏
感，可提供有关
细胞内精细结构和颗粒性质的信息
测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得
到FS-SS图，由此可
仅用散射光信号对未
染色的活细胞进
行分
析或分选。此为血细
胞分类的基本原理，
但不能分析表面分子。
光散射测
量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
•荧光信号由被检
细胞上标记的特异性荧光染料受激
发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
•每种荧光染
料会产生特定波长的荧光和颜色，通过
波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧
光信号
区分开，送入不同的光电倍增管。
•选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的
多个不同
特征。
•线性放大器和对数放大器
荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会
产
生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下
发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另
一
种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得
到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和
定
量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。
荧光染料的特性
•激
发波长(EXCITING)
•发射波长(EMISSION)
荧光补偿
•荧光补偿是用电子的方法校正荧光染料光谱之
间叠加所造成的误差，在完成双色以上
的免疫
荧光分析时都需要作颜色补偿。