2012年中考-三年级数学教案

第
BO
卷第
6
期
2OO4
年
11< br>月
[
文章编号
]
吉林大学学报
<
医学版
)< br>JOurnalOfJilinUniversity.6
NOv.2OO4
975
1671-5S7X<2OO4)O6-O975-OB流式细胞术在紫外线照射后细胞内活性氧检测中的应用
Applicationofflowcyt ometryindetectionofUVB
-
induced
cellular reactiveoxygenspecies
刘扬
9
金光辉
9
刘树 铮
%
<
吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室
9
吉林长 春
1BOO21)
[
摘要
]
目的
:
探讨流式细胞术 在细胞内活性氧检测中的应用
O
方法
:
以
297-
二氢二氯 荧光黄双乙酸钠
<
DCFH
-
DA
)
为标记探针
9
通过流式细胞术检测细胞内
297-
二氢二氯荧光黄
<
DCF
)
的荧光强度
9
间接检测细胞内活性
氧的水平
O
结果:
不同剂量
<~O.45
和
O.6O
kJ

m
-2
)
中波紫外线
<
UVB
)
照射后
91
h
小鼠成纤维细胞内
活性氧表达量明显增高
9
达峰值
9分别为对照组的
146%~145%
和
145%96
h
后恢复正 常水平
O
结论
:
利用流式
细胞术检测
UVB
照射后 细胞内产生的活性氧是一种可靠
~
稳定的方法
O
流式细胞术
;
自由基
;
DCFH
-
DA
;
紫外线
[
中 图分类号
][
文献标识码
]
R
B92-BB
A
[< br>关键词
]
活性氧
<
reactiveOxygenspecies9
ROS
)
是指氧
的某些代谢产物和一些反应的含氧产物
9主要包括
超氧阴离子
<
O
2
-
)~
过氧化氢< br><
H
2
O
2
)
和羟自由基
<
OH< br> )
等
O
紫外线辐射导致细胞产生大量的
ROS
9
可 多途径诱发膜脂质过氧化链式反应
9
造成生物膜
和
DNA
的损伤9
从而诱导细胞凋亡
[1]
O
检测细胞内
活性氧的方法很多9
有分光光度计法
~
化学发光法
~
激光扫描共聚焦显微镜法和电 子自旋共振法等
O
分
光光度计法对细胞进行破碎处理
9
重复性较差< br>;
化学
发光法不能检测到细胞内新生成的部分超氧化物和
过氧化物
;< br>电子自旋共振法可直接测得细胞内
ROS
绝对水平
9
但对样本制备要求 较高
9
且只能测得样品
细胞
ROS
的平均值
9
同时 设备昂贵
~
操作复杂
9
一
般实验室难以应用
[2]
O
流式细胞术在单个细胞水平
上检测
ROS
9
结果稳定可靠
9
重复性好
9
是一种较
直观
~
方便快速的方法
O< br>本实验通过中波紫外线
<
ultraviOletB
9
UVB
)
照射
NIH
B
T
B
细胞
9
诱发
ROS
的产生
9
以
297-
二氢二氯荧光黄双乙酸钠
<DCFH
-
DA
)
为探针
9
探讨流式细胞术检测细胞内
ROS
的方
法
O
1
材料与方法
1.1
主要 试剂及药物胎牛血清
<
北京军医兽医防
治中心
)9
DMEM
培养液
<
GIBCO
)9
DCFH
-
DA
<
Sigma
)O
1.2
照射条件及细胞处理光源为
UVB
紫外灯管
<
上海金光灯具厂
)9
剂量率为
6
J

m
-2

min
-1
<
由
本校公共卫生学 院环境卫生教研室测量
)O
小鼠成纤
维细胞
<
NIH
BT
B)
由本室保存
9
胰酶消化贴壁细胞
9
接种于
24
孔平底培养板中
<5>1O
5
细胞

孔
)9< br>每组
4
个样品
9
每孔加
BOO
:L
的
DMEM
培养液
<
含
1O%
胎牛血清
)9
待紫外 线照射后加至
1
mL
9
置
B7C~5%
CO
2孵箱中继续培养
O
实验组分
UVB
照射组和正常
对照组
O
前者再分
~O.45
和
O.6O
kJ

m
-2
B
个
剂量
O
在照后
1~24
h
不同 时间观察实验结果
O
1.B
细胞内
ROS
检测
DCFH-
DA
用无水乙醇溶
-1
解
<
终浓度为
2O< br>:mOl

L
)9
收集细胞
9B7C
避光
负 载
BO
min
9O.O1
mOl

L
-1
PBS
洗
2
次
92OO
目尼
龙网过滤
9
流 式细胞仪
<
BD
9
美国
9
激发光波长
4SS
nm
)
检测
9
每个样品收集
1>1O
4
个细胞< br>9
Cell@uest
软件分析结果
O
1.4
统计学处理采用
Studentt
检验
O
[
收稿日期
]
[
基金项目
]
[
作者简介
]
2OO4-O1-OS
国家自然科 学基金资助课题
刘
%
扬
<197S-)9女
9
吉林省德惠市人
9
硕士研究生
9
主要从事流式细胞 术在生物医学研究中的应用
O
通讯作者
<
Tel
:O4B1-561 94B1;
E
-
mail
:
drliusZ

ya hOO
.
cOm
)

976
吉林大学学报
(< br>医学版
)
第
30
卷第
6
期
2004
年
11
月
2
结果
分别为对照组的
146%~145%
和
145%
均具有显著
性差异
(
P
<0.05);0. 60
kJ

m
-2
UVB
照射小鼠成
纤维细胞后< br>3
h
细胞内
ROS
表达量仍高于对照组

照射后
6
h
其水平基本恢复正常

见图
1
UVB
照射
后不同时间点观察到的量效关系见图
2
从
UV B
诱导细胞内
ROS
的时程关系图中可以
发现

剂量为
0.30~0.45
和
0.60
kJ

m
-2
UVB
照
射后
1
h

小鼠成纤维细胞内
ROS
表达量明显增高

Fig
.1TimecourseofROSchangesinNI~
3
T
3
ce llsafter
irradiationwithdiffeentdosesofUVB
D CF~
-
DA
负载后

Cell@uest
软件检测分析得 到的
流式细胞术直方图见图
3(
横坐标表示荧光强度

纵
坐标表示细胞数

图中
a
为正常对照组

b
为
UVB
照射组

ab
重叠可比较正常对照组与
UVB
照射组
荧光强度的改变
)
图
3
A
~
B
和
D
分别为对照组与
0.30~0.45
和
0 .60
kJ

m
-2
UVB
照射后
1
h< br>直方
图荧光强度的比较

图
3
C
为对照与
0.60
kJ

m
-2
UVB
照射后
3
h
直方图荧光强度的比较

从图
3
可
以看出

UVB
照射后荧光强度均有不同程度的增
强

其中以图
3
D
最为明显

Fig
.3
Th efluorescentintensityhistogramsofNI~
3
T
3
cellsofmouseafterirradiationwithdifferentdose sofUVB
withDCF~
-
DAloading
Fig
.2< br>Dose
-
responserelationshipofROSchangesin
NI~
3
T
3
cellsofmouseatdifferentt imesafterirradiation
withdifferentdosesofUVB
3
讨论
紫外线主要通过直接作用激活某些光敏分子

通过间接作用诱发自由基
~
脂质过氧化反应等途径
来损伤机体细胞

从而产生一系列的生物学效应

同
时

紫外线辐射的刺激能够产生
ROS

后者可通过
以下途径对细胞产生 影响
:@
作用于细胞而干扰细
胞内环境的稳定

如细胞内
C a
2+
浓度的升高
~
能量
缺失和谷胱甘肽被氧化等
;@直接损伤
DNA

影响
基因转录

改变细胞的表型特征

诱导细胞凋亡
;

攻击蛋白质

导致许多蛋白质尤其是具有酶活性
蛋白质功能的丧失

从而诱导细胞凋亡
;@
作用于
细胞膜

诱发脂质过氧化

从而影响细胞的信号传
递系统

激发有关的调控基因

导致细胞凋亡
3

流式细胞术检测细胞内
ROS
是近几年来发展
起来的新技术

当细胞携带荧光素标记物

通过激
光照射区时

受到激发

产生不同波长的荧光信号

这些信号以细胞为中心

向空间
360
立体角发射

产生散射光和荧光信号

其中

前向角散射与被测
细胞的大小有关

通常在流式细胞术的应用中
< br>选
取前向角作为阈值
;
侧向角散射可提供有关细胞内
精细结构和颗粒性 质的信息

这两个参数结合

可
通过设门排除细胞碎片和死细胞

荧光信号有两种

一种为细胞自身受激光激发产生的微弱荧光信号

另一种就是经荧光素标记细胞后

受激光照射得到

刘扬
,
等
.
流式细胞术在紫外线照射后细胞内活性氧检测中的应用
977
的荧光信号
,
进行检测与分析
,
就能了解所要研究
细胞的某些性质
[4]

DCF~
-
DA
标记细胞原理
:
DCF~
-
DA
具有亲
脂性
,
很容易通过细胞膜
,
在胞内被脂酶分解
,
去
酰基形成有极性的
DCF~
,
但
DCF~
不产生荧光
,
由于它的极性
,
可以在胞浆中与
MP
阳性颗粒接
触
,
其中的
~
2
2
等活性氧能够氧化
DCF~
为
DCF
,
在流式细胞仪
525
nm
处检测到绿色荧光
,
其
DCF
形成量与 细胞氧化产物水平呈正比例关系
,
因此
,
其
荧光强度间接代表细胞内 过氧化物的水平
[5]

有资
料表明
,
DCF~
探 针不仅仅针对
~
2

2
发生反应
,
还
可被多种活性氧的成分如

2


~

等氧化形成
DCF
,
因此
DCF
的荧光强度应是细胞内活性氧产生
的总体状况的反映
[6]
另外
,
双氢罗丹明
123
(
D~R
)
也可作为检测细胞内
R S
的染料
,
其原理
与
DCF~< br>-
DA
相同

应用流式细胞术检测细胞内
R S
还需 注意以
下几个问题
:D
设立阴性对照
,
可避免细胞自身荧
光 对实验结果的干扰
G
DCF~
-
DA
在光线的照射
下易被 氧化
,
而在黑暗或光线弱处则氧化较慢

另
外
,
还 受孵育温度的影响
,
所以染色时需要
37C
避
光孵育
[5]
G
检测时
,
为避免细胞碎片和死细胞对实
验结果的干扰
,
需设门将其排除
GD
每个样品测试
结束后
,
用次氯酸钠冲洗 机器
,
避免样本间的相互
污染
G
样品应在染色后
2
h
内上机检测
,
避免荧光
减弱
,
影响实验结果
G
DCF~
-
DA
在水溶液中易水
解
,
应用无水乙醇 或
DMS
配制
,4C
保存
,1
周内
应用
[5]

本方法的不足之处在于不能测定
R S
的绝
对水平
,
在以后 的工作中
,
将进一步探讨对此法的
改进

本实验用
DCF~
-
DA
标记细胞
,
经紫外线照射
(
上接第
974
页
)
诱导细胞内
R S
产生
,
分析其时程和量效变化的规
律

从量效变化曲线看
,
随着
UVB
照射剂量的增
加
,
细胞内
R S
的含量逐渐增加
G
从时程变化曲线
看
,
不同剂量的
UVB
照射后
1
h
,
细胞内
R S
产生
迅速增高
,
达峰值
G
照射后
6
h
基本恢复正常对照 水
平
,
以后各时间点无改变
,
处于坪值
,
可能与瞬 时
产生的
R S
迅速被机体抗氧化防御系统清除有关

0.6
kJ

m
2
UVB
照射后
3
h
,
细胞内
R S
的含 量
虽稍有回落
,
但仍高于正常对照组
,
可能是较大剂
量UVB
照射导致细胞内
R S
相关酶类的破坏
,
其
清除率下降

[
参考文献
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牙合间隙过短
,
其他余留牙也有不同程度磨耗

检查中发现用一般方法修复十分困难

故采用铸造局部义齿加牙合垫
,
适当抬高
垂直距离
,
前牙区做铸造网加塑料牙合垫
,
使下前牙与上 基托有接触关系
,
后牙排列达到相对正常牙合关系

义齿戴出后
,< br>随访
5
年
,
患者无任何异常症状
,
咀嚼功能良好,
同时垂直距离抬高后改善了面容
,
也达到了美观要求
,
患者满 意

2
讨论
由于老年人的牙合关系异常
,
尤其是牙合间距离 过短
,
仅用一般手段修复十分困难
,
采用牙合垫抬高颌间距离的方法
,
利用铸
造钴铬合金制作的局部义齿
,
解决了牙合关系异常
,
同时
,
达到了修复缺牙的目的

垂直距离变低
,
面下13
相对变低
,
人的
面容显苍老

在制作义齿过程中适 当地抬高牙合间距
,
恢复了面下
13
的高度
,
建立了正常的 上下牙合接触关系
,
不仅咀嚼功能
大大提高
,
同时改善了面容

牙合垫的放置及厚度应根据上下牙合生理间隙而定
,
一般金属牙合垫
2. 0~2.5
mm
,
塑料牙合垫可适当
加厚

使用铸造局部义 齿修复增加了局部义齿的强度
,
基托不易拆断
,
基托的面积和厚度都比塑料基 托小而薄
,
许多患者戴
着更耐用舒适

铸造义齿制作工艺复杂
,
价格要比塑料义齿贵

但铸造义齿具有更好 的光洁度
,
不易有菌斑滋生
,
有利于患
者保持口腔卫生
,< br>同时也美观
(
邮编
:
吉林长春
130022)

流式细胞术在紫外线照射后细胞内活性氧检测中的应用
作者：
作者单位：
刊 名：
英文刊名：
年，卷(期)：
被引用次数：
刘扬， 金光辉， 刘树铮吉林大学公共卫生学院,卫生部放射生物学重点实验室,吉林,长春,130021
吉林大学学报（ 医学版）
JOURNAL OF JILIN UNIVERSITY(MEDICINE EDITION)
2004,30(6)
6次

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