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肾小管上皮细胞钙通道与尿路结石形成的相关性研究
( 限 400 字) ：
尿石症的病因未明， 其发病率和复发率较高， 防治措施令人不满意。 设想某种病理因素
使肾小管上皮细胞的钙通道部分或完全失活，肾小管对钙的重吸收减少，导致尿钙的排出增
加，可能为尿路结石形成的机制。本实验在既有钙通道与高尿钙相关研究的基础上，进一步
摘
研究钙通道与尿路结石形成的相关性。通过制备
要
Vit D
缺乏实验动物模型，分别用免疫组化
技术及荧光探针钙图像技术观察实验模型钙通道表达、钙离子分布的变化与尿路结石形成的
关系；比较伴有高钙尿症的尿石症患者、无伴高钙尿症的尿石症患者及非尿石症患者肾小管
上皮细胞钙通道的表达差异，为寻找尿石症的病因提供实验依据；通过体外肾小管上皮细胞
（HEK293）培养，用全细胞膜片钳技术观察钙通道兴奋剂与拮抗剂对肾小管上皮细胞膜钙离
子生物电的改变，寻找改变钙通道活性的药物，为制定尿石症的防治措施提供依据。
关 键
词
(用分号分开， 最多 5 个)
钙离子通道；肾结石；肾小管上皮细胞
报告正文
（一）立项依据与研究内容
1. 项目的立项依据
泌尿 系结
石 是 一个 全 球性 的 疾病 ， 是我 国最常 见的 泌 尿外 科 疾病 之 一。 由 于 当前
尿 石症的 确切 病 因仍 不 十分 清 楚， 导 致 其 发 病 率居 高 不下 ， 治疗
后 复发 率 也很 高，预
防 措施并 不令人满 意。 因 此，对 尿石症 的病因 研究具
有 重要 的临床 意义 。
尿石 症的 的 发 病因 素 包括 遗 传、 环 境、 饮食、
疾病 和 代谢 等 多个 方 面。 其 发 生的
机 制历史 上也 经 过长 期 的探 索
，提 出 了 各 式 各 样的 学 说。 如 肾乳 头 钙化 斑 学说 ，基质
模 板上形
成学 说 ，结 石 首发 于 肾淋 巴 系 统 学 说 ，尿 液 晶体 胶 体失 衡 学说 及 尿液
的过饱
和 结晶和 抑制 物 学说 等 。这 些 学说 只 在 结 石 形 成的 某 一片
段 或某 一 方面 阐 述结 石的形
成 机制， 而且部分 机制 还 未得到 全面、 深入的
研究。
钙代 谢异 常 是 近年 研 究较 多 的引 起 尿路 结石的 重要 因 素之 一
。钙 是 泌尿 系 结 石成
分 中最主 要的阳离 子，Dau don 等 对 10617
份泌 尿系结 石标 本 作红 外 光谱分 析，发现 86%
的 泌尿系 结石含有 草酸 钙
，80%含有 磷酸钙。文 献统 计至少 40 ~50%的尿 路结石 患者合并
高 钙尿症
。我们对 8 4 例复 杂 性肾结 石标本进 行结石 化学成 分分析 ，其 中 70 例（
83.3% ）
为 含钙成 分的混合 结石；而 且发 现 至少 19.3% (1157)
的小儿 上 尿路 结石合 并 高钙 尿症。
物 理化学 研究 表 明， 尿 液中 的 草酸
钙 和 磷 酸 钙 的饱 和 度与 尿 钙的 浓 度有 关 ，尿 钙增高
易 于诱发
或促进含 钙尿 路 结石的 形成。
高钙 尿症 的 病 理生 理 机制 的 研究 ，包括
甲状旁 腺素 的 作用 、 高钙 饮 食、 骨 代 谢异
常 、细胞 因子 的 作用 、
遗传 因 素、 钙 通 道 或 钙 泵等 方 面。 近 年来 人 们对 钙 通道 及钙的
机
体代谢 进行了深 入的 研 究：
血清 钙正 常 水 平的 维 持依 赖 于肠 道 对钙
的吸收 、骨 钙 的释 放 、肾 对 钙的 重 吸 收的
调 节作用 。正 常 情况 下
，体 内 并不 存 在 骨 钙 的 过度 释 放或 沉 积过 程 。体 内 钙环 境的正
常
维持实 际上 取 决于 肠 道钙 吸 收和 尿 钙 排 泄 的 平衡 关 系。 无 论在 肾 脏和
在 肠道 ，钙可
通 过被动 滤过 和 主动 重 吸收 两 种途 径 进 入 细
胞 外液 。 而钙 的 主动 重 吸收 由 钙调 激素包
括 1,25- 二 羟维生素
D
3
和 甲状 旁 腺素（ PTH） 进行 调节。 钙的主 动吸收 主要发 生 在近
端
小 肠与肾 的远曲小 管（DCT） 和集合 管（ CNT）。
从细 胞水 平
看, 钙 的主 动 吸收 过 程 分 为 三 个步 骤: 1、 钙 离子 通 过管 腔 膜的 钙
通道
（ TRPV
5 6
） 进入小 肠或肾 小管 上 皮细胞 ；2 、在细
胞内 ， 钙离子与 钙结 合蛋白 结合（包
括 钙结合 蛋白 D28 K 和 或 D9K），
弥散 至 基底膜 侧；3、 钙 离子通过 钠- 钙交换 （NCX
1
）
和
或 钙-ATP 酶主动 转 运进 入细胞 间隙 。管 腔膜 的钙 通 道（ TRPV
5 6
）是 钙主动 吸收的主
要 限速步 骤，对维 持钙 的 体内平 衡至关 重要。
2004 年 12 月 ~2005 年 12 月， 本课题组
进 行《二 羟吡 啶 在实 验
小鼠 草 酸钙 结 石 形 成 的 抑制 作 用》 研 究， 发 现钙 通 道兴 奋剂二
羟
吡啶可 明显抑制 实验 小 鼠尿钙 的排出 及肾脏 草酸钙 结 石的 形成。
研 究 离 子
通 道 功 能最 直 接 方 法是 用 膜 片 钳 技术 直 接 测 定通 过 离 子 通 道的 电
流 或
测 量细 胞 膜 电 位的 变 化 。 膜 片钳 技 术 是 利用 一 个 玻 璃吸
管 电 极 完 成 膜 片 或 全 细胞 膜
电 位的 监 测 、 钳制 和 膜 电 流
的记 录 ， 通 过观 测 膜 电 流的 变 化 来 分 析 通 道 个 体 或群 体
的
分子 活 动 、 探讨 离 子 通 道 的特 性 。 膜 片钳 技 术 的 优点 就 是 在 通 道
电 流 记 录 中， 可
分 别于 不 同 时 间、 不 同 部 位 ( 膜 内 或 膜 外
) 施 加 各 种 浓度 的 药 物 或 毒素 ， 研 究 它们 对
通 道功 能 的 可
能影 响 。 通 过 研究 ， 一 方 面可 深 入 了 解哪 些 选 择 性 作 用 于 通 道
的药 物
和 毒素 影 响 人 和动 物 生 理 功 能的 分 子 机 理； 另 一 方
面， 分 析 各 种 药 物 对 通 道 蛋白 的
选 择 性 相 互 作 用 的 特 点
， 提 供有 关 通道 蛋 白亚 单 位 结 构 与 功 能 关 系的 信 息。
分 子 生
物 学 技 术 为离 子 通 道 的分 子 结 构 分 析、 基 因 克 隆、 功 能 表 达 研究
提 供 了
有 力工 具 ， 对 于编 码 离 子 通 道亚 单 位 的 基因 结 构 可
采用 基 因 定 位 克 隆 确 定 其 染色 体
上 的 定 位 ， 用 逆 转 录- 聚
合酶 链 反应 、 Nort her n 杂交 等 明确 其 在器 官 组织 中 的分 布 ，
用 Western 杂 交 检 测基 因 表 达产 物 等。 荧 光 探 针 钙 图 像 技
术 为 检测 细 胞内 游 离钙 离
子 浓 度提 供 了 有 效 手 段 ，常 用 的 荧
光 探 针有 F ura -2 AM、 I ndo -1 AM、F luo -3 AM、
Calc ium Gr een 等 ，常 用 的 检测 仪 器有 双 波长 显 微荧 光 光
度 计 、激 光 扫 描共 聚 焦显 微
镜 等 ，目 前 国 外 Ol ymp us
、Ze iss 、Sp ex 等 公 司 已 生 产 了 测 定 细 胞内 游 离钙 离 子的 显
微 荧光 装 置 。 将离 子 浓 度 图 像和 膜 片 钳 记录 结 合 ， 同时 进 行
光 电 联 合 检 测 ， 从离 子
产 生的 离 子 浓 度、 图 像 变 化 和电 信
号 变 化多 个 方 面 研究 离 子 通 道 ， 将 获 得 更 多的 离
子 通道 功
能 信 息。 对 获 得 性 离子 通 道 病 ，主 要 采 取 患者 血 清 或 提 纯 的 免
疫 球 蛋白 被
动 转移 或 人 工 重组 抗 原 主 动 转移 于 整 体 实验 动 物
的 免疫 方 法 ； 或 将 传 代 细 胞 与患 者
血 清或 纯 化 的 抗体 共 同
培 养 ，而 后 对 其 电生 理 改 变 进行 检 测 。 通 过 制 备 离 子 通道 病
研 究模 型 ， 结 合分 子 生 物 学 、膜 片 钳 记 录、 荧 光 探 针钙 图 像
分 析 、 细 胞 内 电 生理 记
录 、免 疫 组 化 等多 种 技 术 进 行在 体
和 离 体实 验 研 究 ，是 目 前 离 子 通 道 病 的 主 要研 究
策 略 。
设想 在某 种 因 素（ 包 括遗 传 、激 素 或饮 食因素 ）使 肾 小管 上 皮细 胞
钙通 道 部 分或
完 全失活 ，导 致 肾小 管 对钙 的 重吸 收 减 少 ， 导 致尿
液 钙的 排 出增 加 ，可 能 成为 高尿钙
症 和尿路 结石 形 成的 机 制。 本
实验 在 既 有 钙 通 道与 高 尿钙 相 关研 究 的基 础 上， 进一步
研 究钙通
道与尿路 结石 形 成的相 关性。 通 过制 备 Vit D 缺 乏 实 验 动物 模 型， 分
别用 免
疫 组化 技 术 及 荧光 探 针 钙 图 像技 术 观 察 实验 模 型 钙
通道 的 表 达 、 钙 离 子 分 布 的变 化
与 尿路 结 石 形 成的 关 系 ；
比 较伴 有 高 钙 尿症 的 尿 石 症患 者 、 无 伴 高 钙 尿 症 的 尿石
症
患 者及 非 尿 石 症患 者 肾 小 管 上皮 细 胞 钙 通道 的 表
达 差异 ， 为 寻 找 尿 石 症 的 病 因提 供
实 验依 据 ； 通 过 体外 肾
小 管 上皮 细 胞 （ HEK2 93 ） 培 养， 用 全 细 胞 膜 片 钳 技 术 观察 钙
通 道兴 奋 剂 与 拮抗 剂 对 肾 小 管上 皮 细 胞 膜钙 离 子 生 物电 的 改
变 ， 寻 找 改 变 钙 通道 活
性 的 药 物 ， 为 制 定 尿 石 症 的 防治
措 施提 供 依据 。
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transp ort
Effects
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of vita
min D c ompounds
in 25 -hydroxyvit amin
2-9.
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J Am Soc
D3-1alpha-
hydroxylase
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knockout
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2. 项目的研究内容、研究目标 , 以及拟解决的关键问题。
研究目标：
探讨 肾小 管 上皮 细 胞钙 通道 的 表达 与 尿 路 结 石 形
成的 相 关 性 , 为 寻 找 尿 石 症 的病
因 和制定 尿石症的 防治 措 施提供
依据。
研究内容：
１、 制备 Vit D 缺乏实 验动 物 模型， 观察实 验模型
尿路结石 的形 成情况、 观 察钙
通 道在肾 单位的分 布、测 定肾小 管上皮 细 胞内
钙离子 浓度、 观察钙 通道 mRNA的表达水
平 及记录 小管膜内 外钙 离 子电流
的变化 。
２、 比较 伴 有 高钙 尿 症的 尿 石症 患 者、 无伴高 钙尿 症 的尿
石 症患 者 及非 尿 石 症患
者 肾小管 上皮细胞 钙通 道 的表达 差异。
3、通过体 外肾小 管上皮 细胞（ HEK293）培 养 ，观察 钙通道兴 奋剂 与拮抗剂
对 肾小
管 上皮细 胞膜 钙 离子 生 物电 的 改变 ， 寻 找 改 变 钙通 道 活性
的 药物 ， 为尿 石 症的 防治提
供 依据。
拟解决的关键问题：
1、成功制 备 Vit D
2、用 抗 Tamm-Horsfall
缺乏实
验动 物 模 型。
蛋 白免疫方 法提 取 和培养 远曲小 管上皮 细胞
3、熟
悉运用 荧 光 探 针 钙 图 像技 术 、免 疫 组化 技 术、 全 细 胞 膜 片 钳 技 术
。
4、 体外 肾 小管 上 皮细 胞（HEK293 ） 培养。
3.
拟采取的研究方案及可行性分析。 （包括有关方法、 技术路线、 实验手段、
关键技术等说明）
研究方法：
一、 制备 Vit D 缺乏 组及空 白对照 组实验 动 物模 型，通
过 HE 染色 技术观察 尿 路结
石 的形成 及肾 单 位的 病 理改 变 情况 ， 通
过 免 疫 组化 技 术观 察 钙通 道 在肾 单 位的 分布，
通 过 Fluo 3Am
标记的 分子探 针 技术 测定肾小 管 上 皮细胞内 钙离 子 浓度， 通 过 RT-
PCR
法 观察钙 通道 mRNA的 表 达水 平，通 过全细 胞 膜片 钳记录
技术 记 录小管 膜内外 钙离子电
流 的变化 。并比较 两组 各 观察指 标的差 异。
二、 选取 伴 有 高钙 尿 症的 尿 石症 患 者、 无伴高 钙尿 症 的尿 石 症患 者
及非 尿 石 症患
者 ，采用 抗 Tamm-Horsfal l 蛋白 免疫方 法 提取
和培养 远曲 小 管上皮 细胞 ， 用 RT-PCR 法
测 定 TRPV5 和 TRPV6
mR NA 的 表达水 平， 并 比较三 组的差 异。
三、 进 行体 外 肾小 管 上皮
细胞（ HEK293 ） 培养 ，通过 全细 胞 膜片 钳 记录 技 术 ，观
察 钙通道
兴奋剂与 拮抗 剂 对肾小 管上皮 细胞膜 钙离子 生 物电 的改变 。
技术路线：
一 、 动物 实验：
② 随机分为 Vit D 缺
③分别予相应应饲料喂
①选用 SD 大鼠 40 只
乏组和空白对照组 养 8 周
⑴HE
染色观察肾脏病理与结石形成情况
⑤取左肾作病理切片
④断颈处死大鼠，取双
⑵免疫组化观察 TPV56 在肾脏的分布
肾供实验用
⑶分子探针技术测定小管细胞内钙离子浓度
⑥ 取右 肾，抗 Tamm-Horsfall
蛋白 免
疫 方 法 提 取 和 培 养 远曲 小 管 和 集合
⑷RT-PCR
测定小管 TPV56 的表达水平
管 上皮 细胞
⑸全 细胞 膜片 钳记 录小 管细
胞生 物电 改 变
二 、 临床 试验：
伴高钙尿的尿石症患者
抗
Tamm-Horsfall
开放手术同时取小块肾
无伴高钙尿的尿石症患者
组织
无尿石症的原发性 UPJ 梗阻患者
和 培 养 远曲 小 管
上
皮 细胞
异
蛋 白 免 疫方 法 提 取
水 平，并 比较 三
组 的差
和 TRPV6 mRNA 的 表达
RT-PCR 法测 定 TRPV5
三 、 离体 实验：
空白对照组
人胚肾小管上皮细
胞（HEK293 ）
二 羟吡 啶组
全 细 胞 膜 片
钳 记录 小管 细胞 三组 因钙 离 子内
流 的生 物电 改变 ，并 比 较 三组 的差
异
硫 氮卓 桐组
实验方案：
一 、 动物 实验：
1、实
验动物及 分组 由广 州医学院 实 验动 物中心 提供 ,21 天 龄 SD大 鼠 40 只 ,
雌雄
各 半, 体重 34~52g ，随机 分成 VitD 缺乏组 及对照 组，每 组 20
只 。 VitD 缺乏 组予喂纯
净 水和缺 乏 VitD 饲料 配 方（ %） : 玉 米
粉 76g ，蛋清 粉 5g ，小 麦 麸质 13g ，碳酸钙 5g，
氯 化钠 1g（该
配方经 云南 省 科委检 测不含 VitD ）。对照 组予 喂 自来水 和基础 饲料配方
（
%） : 玉 米粉 30g ， 麦麸 35g ，鱼粉 8g， 豆饼 20g ，酵 母粉 5g，骨粉
1g， 盐 0.5g ，蛋
氨 酸 0.1g ，VitD
3
0.1g ，
多 种维 生素 0.2g; 含钙 量达 1.18% 。 动 物置于 避光室 中，双鼠
一
笼喂养 ，自由进 食， 共 喂养 8 周。断 颈处死 两组大 鼠, 取双 侧 肾脏供 实 验用 。
2、观 察项目：
2.1 观察 肾 结 石情 况 ： 左 肾用 福尔 马 林 液固
定 , 石腊 包埋 , 切 薄 片, 半 数 切 片 留作
2
2.4 ， 其余常规
HE 染色 , 在 偏光显 微镜下 结晶结 石及肾 脏 组织 改变, 病理分 级 5 级，两
检验 。
组 比较用 χ
2.2
Hirnet
2.3
钙通道 TPV
5
和 TPV
6
肾 脏 免疫
组化表 达： 运 用 2.1 方 法制备 石腊波片 ，参照
方法的免 疫组化 技术， 比较两
组 TPV
5
和 TPV
6
在 肾单位各 部位的 分布差 异。
测定远 曲小管 上 皮细 胞（DCT）和 集合管 上皮细 胞（CNT） 内钙浓 度：取
右肾，
的抗 Tamm-Horsfall 蛋白免 疫 方法 提取和 培养 远 曲小 管
和集合 管上皮细 参 照 Pizzonia
胞 ，将细 胞传代于 直径 3 5mm 塑
料培养 皿 中, 待 24 小时 细胞 贴 壁生 长 并用不 含血清的
1640 培 养基冲
洗两 遍 , 加 入 Fluo 3Am 分子 探 针(Fluo 3Am) 来 源于美 国分子
探针), 在
37 ℃下温 育 30 分钟 , 并 再 次用 不含血 清培 养 基冲洗
1～2 遍 , 立 即在激 光共聚 焦扫描显
微 镜(Ultima212,Meridi an
公司产 品 ) 下观察 , 每 组随 机 取 5 个视 野 , 计 算细胞 总数及总
荧
光值, 取其 平 均值 为 平均 细胞内 钙浓度 值, 不 同组 的 平均 细 胞内 钙 离子 荧
光强 度值比
较 用秩和 检验。
2.4 RT-PCR 法测定 远曲小 管和 集
合管 钙 通 道 mRNA 表 达水 平 : 取 培 养 的对 照 组及
提取细 胞总
RNA,经 紫外分 光光度计 VitD 缺 乏组远曲 小管和 集合管 上 皮细 胞, 用
Trizol
分 析 A260A280 均为 1.8 以上 用 supercr ipt
Ⅱ逆转 录酶 合 成 cDNA, 用 elon gase 酶混
合 液进行 扩增。PCR产
物经 1%琼 脂糖电 泳, 在 GeL 1000 凝胶 成像 系 统上扫 描, 分别测α
1
, β , α
2
δ与β -actin 条带 的 A 比 值。参照 Yo
ichi 等 引物设计 。计 量 资料数 据采用—
X± s 表示 , 配 对资料 采用 t
检验, 组间 比 较采 用方差 分析 。
2.5 全细 胞 膜片 钳 记录 ： 将两 组
原代培 养的远 曲小管 上皮细 胞放入 恒 温灌 流 槽内
用 台氏液 灌流, 选择表 面
光滑 、搏动规 律、频 率 中等的 远曲小 管上皮 细胞作 为 实验 对象。
实 验在
35-37 ℃条 件下完 成 。调 节三维 操纵 器 将电极 压在细 胞表面 , 稍 施负压
即可形成
高 阻抗封 接, 施 加脉 冲 负压 或给予 短暂 的 电脉冲 击穿膜 片, 即
形成 全 细胞 记 录模 式补偿
电 容电 流 和串 联 电 阻后 , 通 过膜
片 钳 放大 器( Axopatch200-A , 美国 ) 发 放刺激 冲动, 激发
的
电信号 经 AgCl-Ag 电极 引 导, 放大 器放大 , 由 模数转 换器转 换为数 字信号 ,
储 存于计算
机 硬盘中 以备分析 。数 据 采用— X± s 表 示, 配对资 料采 用
t 检验 。
二 、 临床 试验
1、试 验分组 ：A 组为 伴有高 钙尿症的
肾结石 患者：术 前尿 液检 查 连续两 个 2 4 小时尿
钙 大于 0.1mmol(kg
· 24h);I VP 提 示 单侧 肾 脏内 >3cm 大小肾 结 石, 且具 备行肾 盂肾实质
切 开取石 术手术指 征, 同 时不 合并其 他泌 尿 系疾病 。B 组 为不 伴 有高钙
血症的 肾结石患
者 ：术前 尿液检查 连续两 个 24 小时尿 钙小于
0.1mmol(kg · 2 4h);IVP 提示 单侧肾脏
内 >3cm 大小肾 结石,
且具 备 行肾 盂肾实 质切 开 取石术 手术指 征 , 同时不 合并其 他泌尿系
疾
病。C 组 为无合 并泌尿系 结石的 的原发 性 UPJ 梗阻 患者: B 超及 IVP 检查均
排除泌尿
系 结石, 按照《 吴阶平 泌 尿外 科学》 第三版 原发性 UPJ 梗 阻 的诊
断标准 进行 诊 断，具有
开 放手术 解除梗阻 手术 指 征。各 10 例。
2、实 验方法： 三种患 者在 开 放手术 治疗的 同时取 出小块 肾 组织 ， 参照
Pizzon ia 的
抗 Tamm-Horsfall 蛋白 免 疫方法 提取和 培养远
曲小管 上 皮细 胞，参 照 2.3 法 RT-PCR 法
测 定 TRPV5 和
TRPV6 mRNA 的 表达水 平，并 比 较三 组的差 异。 计 量资 料 数据采 用— X±
s 表 示, 配对资料 采用 t 检验, 组间 比较 采 用方差 分析。
三 、
离体 实验：
1、肾 小管上皮 细胞的 选 用： 选用人 胚肾小 管上皮 细胞（
HEK293 ）， 于伯森生 物科技
股 份有限 公司购买 。
2、实 验分组：
(1) 空白 对 照组： 对培养 的 HEK293 不作任 何 处理 ；(2) 二 羟 吡啶组：
加 入二羟 吡啶( 终浓度 9 μmolL) 至 HEK293 悬液 ；(3) 硫氮卓桐
组: 加入硫 氮 唑酮 ( 终浓
度 9μmolL) 至 HEK293 悬液。
3、全 细胞膜片 钳记录 ： 方法 同上， 比较 三 组 HEK293 的 I Ca 的平均
电流 密 度差异。
数 据采用 — X± s 表 示, 配对资 料采 用 t 检验 。
可行性分析
1、本 研 究是 在 钙道 道深入 研究的 基 础上 进行 肾 小管 上
皮细 胞 钙通 道 与 尿路 结 石形
成 的相关 性研究， 具有 较 强的理 论指导
和实践 意义。
2、本 研究所应 用的免 疫 组化 技术、 RT-P CR 技术 、 抗
Tamm-Horsf all
提 取技术 、全细胞 膜片 钳 记录均 为开展 多年的 成熟技
术 。
3 、 本 研 究由 Dept of Physiology
center
at Dallas
University of Texas Southwestern
Medi cal
蛋白免 疫方法
的教 授提供 理论咨 询 和技 术支持 。
4、我 院 其腔 内 泌尿 外科技 术处于 国 内领 先地 位 ，对 尿 石症 的 基础 和
临 床研 究 积累
较 多的经 验，而且 可提 供 充足的 病例供 实验和 临床研 究 。
4. 本项目的特色与创新之处。
本项 目通过制 备 Vit D 缺乏 组及空 白对照
组 实验 动物模 型， 通 过 HE 染色技 术 观察
尿 路结石 的形 成 及肾 单 位的
病 理改 变 情 况 ， 通 过免 疫 组化 技 术观 察 钙通 道 在肾 单位的
分
布，通 过 Fluo 3Am 标记 的分子 探针技 术 测定 肾小管 上皮 细 胞内钙 离子浓
度，通过
RT-PCR 法观察钙 通道 mRNA 的表达 水平，通 过 全细
胞膜片 钳记 录 技 术记 录小管 膜内外钙
离 子电流 的变 化 ，观 察 钙通 道 兴奋
剂 与 拮 抗 剂 对肾 小 管上 皮 细胞 膜 钙离 子 生物 电的改
变 ，初步
探讨泌尿 系结 石 的形成 机制. 并 为 制定尿 石症的 防治措 施 提供 实 验依 据。
5. 年度研究计划及预期研究结果。 （包括拟组织的重要学术交流活动、 国际
合作与交流计划等）
2006 年 5 月~2007 年 2 月
2007 年
3 月~200 7 年 10 月
2007 年 11 月~2008 年 3 月
2008 年 4 月~2008 年 7 月
2008 年 8 月 ~2008 年
12 月
取 SD 大鼠 分别进 行随 机 分组、 饲养
分别进 行 HE 染色
、免疫 组化 技 术、 RT-PCR、 细胞内钙
浓度 测定、 全细胞 膜片钳 记录，
同期按 照分 组 标准收集
临床 试验病 例标本
课 题 组赴 美国 Dept of
Physiology University of Texas
Southwestern
Med ical cent er at Dallas 学习 后期试验
相关技 术，共
同开展本 项研究
抗 Tamm-Horsfall 蛋 白 法提 取和培 养远 曲 小管上皮
细胞
RT-PCR 法 测定 TRPV5 和 TRPV6 mRNA 的 表达 水平
选用 人 胚肾小 管上皮 细胞（ HEK293） 进行 分组离体 试验
整理 实验数
据 ，进 行统计 学分 析 ，得 出 实验结 论，发表
相关 论文， 若有进展 性 发现
申报科 研成 果 。