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植物组织切片实验步骤
一、 野外采样
枝条采样：选取冠层阳生枝条，一般 长度约50cm，直径约1-2cm。用高枝剪采集，做好采样
记录和样品标记，装入黑色塑料袋内，带 回实验室。
叶片采样：选取健康叶片进行采样。根据试验需要，一般采集冠层阳生叶片。做好采样记录
和编号后，装入黑色塑料袋或自封袋，带回实验室。

二、植物叶片生理性状测定：
叶片面积（Aleaf）测定：对于野外采回来的叶片,在叶面积仪(LI-3000A,LI- COR,Nebraska)
上测定叶面积；
叶片干重（Wleaf）：将干净,新鲜的叶片 ,放在70°C的烘箱中48小时，然后用电子天平测
量叶片干重；
比叶面积SLA（比叶重 LMA）：SLA=LA（叶面积）DW（叶片干重）；
叶片饱和重（Wleaf_saturate d）：将叶片放在纯净水中，浸泡24h，从水中取出后，擦干叶
片表面水分后立刻测定其饱和重；
叶片相对含水量（SWCleaf）：=（叶片鲜重-叶片干重）（叶片饱和重-叶片干重）；
叶片元素含量测定（Lean Nutrients）：全碳、全氮：碳氮分析仪测定；全磷、全钾：H NO3-HClO4
消解，HCl溶解，ICP-AES测定（LYT 1270-1999）；
叶片稳定性碳同位素（δ13C）：样品经研磨后过100目筛，准确称量4.000- 5.000m g样品
用锡舟包裹放入EA自动进样盘，进行高温燃烧裂解生成CO2，生成的气体经二氧化碳吸
附柱最终分离，并由载气He带入离子源离子化后进行检测，设置580秒时通入CO2气体
（>99 .999%)作为参考气体，持续30秒，通过参考气体与样品气体的检测对比，最终得
到13C12C 的比值。反应温度：920℃和600℃；
叶片长期内禀水分利用效率（iWUE）计算：叶片δ13 C值是负的并且与细胞间与环境的时间
比呈线性关系，与叶片内的长期水分利用效率（iWUE）正相关 。

三、枝条生理性状测定：
木材体积（Vwood）：用排水法测量木材体积；
木材干重（Wdry）：将干净的剥皮的木材放在烘箱中７０°Ｃ72h，称取其重量；
木材鲜重（Wwet）：将采集回来的材料，在电子天平上称量其鲜重；
木材饱和重（Wsa turated）：将剥皮的干净的木材放在纯净水中浸泡48h，后用纸将表面的
水擦干净后在电子天 平中称量饱和重；
木材相对含水量（SWCwood）：=木材饱和重-木材鲜重木材饱和重- 木材干重
木材密度（Wood density）：=木材干重木材体积
皮厚度：用游标卡尺测量皮的厚度；
髓芯大小（面积）：用游标卡尺测量髓芯的直径并计算其髓芯面积


植物叶片解剖特征的测定：
1. 叶片组织石蜡切片制作（见附件一）；

2. 叶片组织厚度测定（附件二）：叶片厚度，栅栏组织，海绵组织，上下表皮，角质层
3. 叶片气孔特征：叶片气孔制片（印迹法- 指甲油，徒手切片法）；气孔密度，气孔保卫细
胞大小，气孔指数（气孔数量与表皮细胞个数的比值）；
4. 叶脉密度测定：透明叶制作方法；徒手切片法；叶脉密度计算。

枝条解剖特征的测定：
1. 枝条组织石蜡切片制作（见附件一）；
2. 导管大小和密度测定（见附件三）：
3. 理论导水率计算：
4.
附件1、植物组织石蜡切片法
实验材料和试剂：FAA固定液、无水乙醇和石蜡、二甲苯或柠檬烯
一般可以经得住石蜡法中 各种试剂处理的材料都可以用石蜡法制片。石蜡法的优点为能切成
极薄而且连续的切片，是显微技术上最 重要最常用的一种方法。
1 、选择材料
选择健康的材料，勿使其变干,可放入水中或者用湿纸包裹起来，尽快带回到实验室中固定。
2、 材料固定
使用FAA固定液：FAA 福尔马林5% 醋酸5% 70%酒精90%
①实验材料体积：为了使固定液迅速地透入材料，体积不宜大， 以不超过0.5-1cm3为好，
圆柱状的材料，其直径超过1CM者，应劈成半圆或14或者更小；
②固定液的体积：材料切好后，应立即投入固定液中，固定液应至少为材料的10倍，含水
较多 的可多至50倍以上；
③固定时间：薄的叶片 12h左右， 厚叶片大于24h，木材和枝条大于1 星期；对于硬度较
大，或者体积较大的材料，要给其充足的固定时间。
3 、冲洗
先用流水冲洗五分钟，后用与配制溶液浓度相同的70%酒精进行冲洗；
4、脱水
固定好的材料经各级浓度的乙醇脱水至无水乙醇，一般应用的各级乙醇是95%的乙醇配制而
成；脱水乙 醇的用量为材料体积的3-5倍，每级停留时间1-6小时（视材料的大小和性质而
定）
①叶片：将样本从固定液中换到70%的乙醇溶液中过夜---将样本换到80%的乙醇溶液中（2h）
---将样本换到85%的乙醇溶液中（2h）---将样本换到85%的乙醇溶液中（2h）---将 样本换
到95%的乙醇溶液中（2h）---将样本换到100%的乙醇溶液中（1h）---将样本换 到100%的
乙醇溶液中（1h）---将样本换到1：1的乙醇柠檬烯溶液中（过夜）
②枝条和木材：将样本从固定液中换到70%的乙醇溶液中过夜---将样本换到80%的乙醇溶液中（3-5h）---将样本换到85%的乙醇溶液中（3-5h）---将样本换到85%的乙醇溶液中（ 3-5h）
---将样本换到95%的乙醇溶液中（3-5h）---将样本换到100%的乙醇溶液中 （2h）---将样
本换到100%的乙醇溶液中（1h）---将样本换到100%的乙醇溶液中（1 h）---将样本换到1：
1的乙醇二甲苯溶液中（过夜）
注意：若材料放入无水乙醇、二甲 苯各半的溶液时，溶液变浑浊，则表示材料脱水不净，此
时应该把材料退回到纯酒精中，再行脱水。
5、透明
试剂：二甲苯或者柠檬烯（无毒，现多作为透明剂）；透明剂的作用是置换乙醇，让 材料透

明，有利于石蜡向材料的内部渗透；用量：不宜多，只需将材料完全盖没为止。
① 叶片：将样本换到纯二甲苯溶液中（2h）---将样本换到纯二甲苯溶液中（2h）
② 枝条和木材：将样本换到纯二甲苯溶液中（4h）---将样本换到纯二甲苯溶液中（4h）
6、浸蜡
浸蜡过程是使石蜡慢慢融入材料的透明剂中，然后以石蜡完全代替二甲苯进入材料的组
织中；
要点：将石蜡溶化在含有材料的透明剂中，然后逐渐增加石蜡的溶解量，并逐渐减少透明剂
的量 ，最后透明剂完全被石蜡取代。
浸蜡方法：先用刀片把低融点石蜡（约48-50°C）切成碎块，加 入三分一左右的碎蜡到二
甲苯溶液中，放入45度烘箱中内过夜---第二天，向实验瓶中加入碎蜡，适 量，不要过多，
每过两个小时加一点，迅速下沉的可以多加点，下沉慢的少加点，飘在溶液上为浸好蜡的 ，
过夜---第三天，再加一遍碎蜡确定都浸好蜡，将烘箱温度调到50度左右，挥发二甲苯---第四天，挥发瓶中的二甲苯，若挥发完毕，将瓶中的石蜡溶液倒出，然后将过滤好的纯蜡倒
入瓶中， 放入烘箱中，52度，白天，62度过夜--- 第五天，如果包埋可以直接进行。或者再
换下石蜡，再浸蜡一天，具体视材料性质而定。
石蜡的回收：将石蜡放在烧杯中煮24h，除去二甲苯，用纱布过滤。
7、 包埋
可从网上买到需要的包埋盒，包埋机在中心实验室，中心实验室的包埋机需要预热半个
小时，在包埋之前 要安排好时间。
包埋需要准备的材料：包埋盒、包埋用的铁盒（也需要在包埋机上进行预热）、记号笔 、
自封袋、镊子、刀片。
具体操作可以现场教学；
8、粘贴剂和载玻片
载玻片在使用前用95%的酒精清洗，放入干净的玻片盒中晾干或者45度烘箱中烘干。
粘片剂：用鸡蛋清和甘油的1:1混合液进行粘片，并加入少量的防腐剂。
9、切片
石蜡切片一般使用转动切片机。
① 切片时，把切片刀装上，再把包埋盒夹在固定的装置上， 调整固着装置，使材料的切面
与切片道口平行，材料的纵轴必须与刀口垂直，否则切片不正。
② 调整厚度标志器，使得厚度适合所需要的厚度，前面修片可以把厚度调大一些，正式切
片时 ，切片的厚度是所切组织细胞厚度最合适（一般叶片8um,枝条12-20um）。
③ 然后，左手 持毛笔，右手转动切片机进行切片，由于切片时摩擦生热，使得切下的拉片
粘成一条蜡带，用左手拿毛笔 把蜡带轻轻托住，用刀片切断蜡带（一般4个材料）。
切片是石蜡切片最重要的一步，切片效果影响后 续的观察。但其切片的效果受到前处理几个
步骤的影响（如固定时间、脱水效果、浸蜡时间和效果等）
有些在切片时不能切成连续的蜡带，或者蜡片卷须，或者不直，或者其他的现象等，有可能
由于 以下原因导致的，故要事先注意，并及时纠正；
③ 切片刀口不锋利，是不能切成连续蜡带的主要原因 。另外，蜡块下边没有调节到和刀口
平行，或者刀刃与蜡块平面的角度不正确，也可以妨碍蜡带的连续。 蜡带上有材料处出
现空洞，是由于石蜡未完全浸入材料中，应退回重新浸蜡；
④ 石蜡太软或 者切片时温度过高，往往使得蜡带皱缩。这种现象在夏天常出现，所以夏天
切片宜用融点较高的石蜡。可 将蜡块储于冰箱中，效果更好。
⑤ 一般切特薄（2-3um）的切片时，需要用硬蜡和低温，否则也 会皱缩。切制太厚时（12um），
石蜡太硬，则容易碎裂。

⑥ 蜡块上下边没有修成二边平行，这样切出的蜡带就会弯曲成弧形，严重的科成半圈状，
而以后无法展平；
⑦ 切片刀刀口某处已钝或者有小缺口（切木材容易出现），可使蜡带上出现条纹或者裂缝，
应 该将刀片移动一个位置。有时刀刃上附有尘土或者蜡屑，也会出现条纹，应注意用毛
笔刷或者废二甲苯擦 洗。
⑧ 蜡块中的材料不在中央，切成的蜡带也不易连续或向一边破碎。
10、粘贴 切片完成后，用毛笔和刀片取合适长度的蜡片（一般4个材料），先放入纯净的冷水中几
秒，然后再 放入45度左右的热水中展片，温度不可过高或过低。将粘片剂滴一滴在干净的
做好标记的载玻片上，用 手指将粘片剂涂抹均匀，然后将蜡带粘在载玻片上。载玻片放在晾
片板上。晾干或者在45度的烘箱里烘 干。
11、脱蜡、脱水、染色
木材样品染色,用番红染色
番红 碱性染料 溶于水4.5%, 也溶于酒精3.5%。经常用其0.5%或1.0%酒精（70%）配成
溶液。
1、 将载玻片放在染色架上，空一格放一个，不要过于挤，影响后面的染色。
2、 放入1 00%的二甲苯中脱蜡2h（脱蜡的时间可以久一点，让蜡脱得彻底一点，有利于后
面的染色，但时间太 长，材料可能会掉）。
3、 将材料换到二甲苯中1h；
4、 将材料换到12二甲苯+12无水乙醇中5min;
5、 将材料换到无水乙醇中5min；
6、 将材料换到无水乙醇中5min；
7、 将材料换到95%乙醇中5min；
8、 将材料换到85%乙醇中5min；
9、 将材料换到70%乙醇中5min；
10、将材料换到番红溶液中8-12h；
11、将材料换到清水中5s;
12、将材料换到70%乙醇中2s;
13、将材料换到85%乙醇中2s;
14、将材料换到90%乙醇中2s;
15、将材料换到无水乙醇中2s;
16、将材料换到无水乙醇中2s;
17、将材料换到12二甲苯+12无水乙醇中2min;
18、将材料换到二甲苯中10min;
注意：从番红中拿出材料，在后面的脱色过程中，时 间要视具体材料而定，染色过深，就脱
色时间久一点，染色浅，脱色时间适当减短；
2.2.10封片与观察
盖玻片需要提前用蒸馏水清洗，然后用吸水纸擦洗干净。
戴上口罩和手套，因为哈气会使得片子发生云雾反应；将切片从二甲苯中取出后迅速滴一滴
光学树胶（加 拿大中性树脂），用镊子夹起盖玻片，从材料的一段轻轻地倾斜的盖上载玻片。
（注意不要产生气泡，树 胶也不要太多），最后放在干净、通风处，自然干燥。

光学显微镜下观察与拍照
所采用的仪器是显微镜，所应用的软件是Leica Application Suite

1）将放有材料的载玻片放在显微镜下，先用低倍镜找到材料，再逐渐调至高倍镜下。

2）打开软件，调整光和清晰度，找到合适的材料位置，准备采集图片，打开Mic1—选择 20X—
点击采集图像。




3）对于弹出的对话框，再次确认采集的倍数是否正确，确认无误，点击采集。

4）保存图片，找到存储位置，修改文件名，一般格式：名字代号-倍数-采集图片排序数。

附件2、片厚度和木质部导管的软件处理

叶片厚度测量案例演示
1） 打开ImageJ—选择File—Open打开目标图片

2） 打开图片

3） 设置刻度：在图片的标尺长度上的两点画一条直线，进入Analyze—Set Scale。

4） 在设置标尺（Set Scale）窗口会显示直线的像素长度，键入 试剂中的长度以及单位。
这样就会在像素和实际长度间建立联系。选择global，表示其他图片也将 应用该标尺。

5） 设置测量指标：Analyze—Set Measurements。可以选择需要测量的指标。如面积，灰
度值等。

6） 测量两点间的距离：在两点间直线，状态栏会显示相对水平线的角度和长度。然后 Ctrl+M，
在结果栏中显示，可复制到Excel中。

附件3木材木质部导管测量案例
1） 前四个步骤同上述叶片的测量步骤；
2） 设置测量指标：Analyze—Set Measurements。可以选择需要测量的指标。Area，Fit
ellipse（测量导管是椭圆）等其他值。

3） 打开图片，转化为8-bit灰度图，ImageJ—Type—8bit.

4）设置阈值：Image—Adjust—Threshold（或快捷键Ctr+Shift+T）。

5)调整阈值：0-255的全部调到255，然后调整0-204阈值，直 到图片出现清晰的红
色导管位置。

6）点击T，会出现测量的结果框。

7）点击Measure，会出现结果列表，上面会有具体的导管面积大小等值。

7） 点击File—Save As，保存实验数据。