心理咨询师三级真题-阴奕彤

项目类别 申报学科代码1 科学部编号
A
C03020303





申



项目名称：


申 请 者：


所在单位：

邮政编码：

通讯地址：

电 话：

传 真：

申请日期：
2000年3月



国家自然科学基金

请
国家自然科学基金委员会
一九九七年制




书

一、简 表



名 中


文

研
称
英


文
究

类别 A. 自由申请 B. 高技术探索 C. 青年 D. 地区

高技术探索



E．重大 F. 重点 H. 专项
A

项目主题号
项

名称2 A. 基础研究

申报 名称1
A
代码2 B. 应用研究
目
学科

代码1

申请金额 起止年月
A
实验室编号

所在实验室 A. 国家重点 B.部门开放

姓 中文

性 A. 男

出生年月

民 名称 汉

名
拼音

别 B. 女 A
身份证号

族
代码

01



学 A. 博士 A.院士
博士学位
国(地区)名

申
专业



B. 硕士 B.博士生导师


技术
授予国别



C. 学士

C博士博士后

代 码
位 或地区
B

职务

名称 系(所) 单位代码
请

所
A. 高等院校
邮政编码名 称

在
性 质 隶属

B. 科研机构


单

申请者电话代 码
关系
者
位
C. 其它 A
所在地
总人数
湖南省
高级
4

中级
4
初级

专业技术

博士后 博士生 硕士生

所在单位名称
及代码

参加单位数
1











项
9
主 姓 名
要
成
员

不
含
申
请
者















1
项目中
的分工
指 导
质粒构建及转染
端粒酶活性检测
MAPK磷酸化检测
身份证号
职务



目














组
细胞培养
动物实验
癌基因活性检测
STAT3磷酸化检测








-1-

摘
研

究

内

容

和


意
要
义
本课题利用分子生物学、细胞培养和免疫学技术从细胞信号转导通路的
角度研究HCV NS3和HCV NS5蛋白对细胞的转化作用。主要探讨①HCV两
种非结构蛋白对MAPK和JAK STAT3信号通路影响；②HCV NS3和NS5主
要是影响级联的哪个环节；③ HCV NS3和HCV NS5两种蛋白究竟哪种对
信号转导通路的影响效用强。本课题将为HCV致癌机制的 研究提供新模
型和实验证据，同时亦为临床防治HCC提供新思路和理论依据。
主题词 1. 主题词数量不多于三个； 2. 主题词之间空一格（英文用分隔）
中 文 丙型肝炎病毒 信号转导 转化
英文

Hepatitis virus Csignal transductiontransformation

简表填写要求

一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所用 代码以最新发
布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术新概
念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右
上角加注“高技术探索课题重点项目”。
二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。
三、部分栏目填写要求：
项目名称 —— 应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。
基础研究 —— 指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。
应用基础研究 —— 指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。
申报学科 —— 申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。
申请金额 —— 以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。
起止年月 —— 起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的12月。
所用实验室 —— 系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的
开放实验室。
所在单位名称及代码 —— 按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填
“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文,例如：
中国航天工业总公司第七0一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未
编入单位代码，其代码暂不填写。
参加单位数 —— 指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位),以
阿拉伯数字表示。
项目组主要成员 —— 指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及项目的完成起重要作
用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。
研究内容和意义 —— 摘要和主题词均录入软盘。
-2-

二、 立论依据
（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）
对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；
对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述
其应用前景。

丙
型肝炎病毒（HCV）与肝细胞癌（HCC）发生的关系 十分密切，但其确切的致癌机
制尚不清楚。我国是HCV高感染区和HCC高发区，故探讨HCV的致癌 机理对HCC的预
防和治疗具有十分重要意义。
分子生物学的应用使人们对HCV的结构和其 在HCC发生中的作用已有初步认识。HCV
是一种正链RNA病毒，无逆转录酶活性，不能象HBV以 “病毒基因组插入”方式激活癌
基因。特别是HCV致癌动物模型难以复制，限制了HCV致癌机制的研 究。目前，普遍推
测HCV可能是通过其表达的蛋白质起作用。其中非结构蛋白NS3和NS5在HCC 发生中的
作用尤其重要，Sakamuro等发现HCV NS3蛋白可使NIH3T3细胞转化，接种裸鼠可形成
肿瘤；我们的研究观察到HCV NS3蛋白主要通过内源性机制间接作用于p53基因使其突变
导致肝细胞癌变；用构建的HCV NS 3蛋白表达质粒（pRcHCNS3-5’）转染NIH3T3细胞，
使细胞端粒酶活性显著增高，但H CV NS3和HCV NS5蛋白是通过何种方式使细胞恶性转
化，尚缺乏直接证据。
既往 研究表明信号转导控制着细胞的生长、分化；信号转导级联异常与细胞的恶性转化
关系密切。RasRa f丝裂原激活的蛋白激酶K（RasRafMAPK）级联反应是一种主要的生长
因子和细胞因子信号转 导通路，包括ras-GTP的形成、细胞膜Raf激酶活化并激活MAPK
激酶（MAPKK）、继而 通过苏氨酸和酪氨酸残基双磷酸化激活MAPK，活化的MAPK移入
核内使三聚体因子（ternar y complex factor）TCF磷酸化，后者再激活立早癌基因如c-fos和
egr-1 。Janus酪氨酸蛋白激酶（JAKs）信号转导和转录激活因子（Stat3）级联是新近发现的
另 一重要的信号转导通路。JAKs系非受体型酪氨酸激酶，使Stat3酪氨酸705（Tyr-705）磷酸化而激活Stat3，活化的Stat3进入核内与DNA应答元件（response elements）结合，引起
基因表达。在肿瘤的发生发展中RasRafMAPK和JAKs St at3信号级联的相互关系文献报道
的结果不一。由于MAPK和Stat3均可被多种生长因子和细胞 因子激活，多数学者认为MAPK
可促进Stat3活化。Chung等观察到MAPK可以使Stat 3丝氨酸727位点磷酸化而激活Stat3；
Leaman等亦发现某些生长因子（EGF和PDGF ）对Stat3的激活并不一定通过JAKs，但Jain
等的结果提示活化的MAPK抑制Stat3 转录活性。
HCV蛋白对细胞信号转导通路的影响慢性肝炎的发生关系在国外已有少数报道：You< br>等观察到HCV核心蛋白能增强由淋巴毒素β受体配体和肿瘤坏死因子α触发NF-κB信号
转导 通路的效用，使HCV感染呈慢性活动和慢性持续状态；Tsuchihara等亦发现HCV核心
蛋白 具有调节信号转导通路和细胞生长的作用；但Heim等的研究表明HCV蛋白可通过
JAK-STAT 信号通路抑制信号转导，并认为这可能是HCV对α干扰素治疗无效和病毒持续
感染的主要原因；Bor owski等发现HCV NS3蛋白可与cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）游
离催化亚单位结合， 阻止催化亚单位进入核内，影响PKA的功能；Tan等观察到HCV NS5A
能特异性地与生长因子受体联接蛋白2（Grb2）的接合器蛋白（adaptor protein）结合，并
作为细胞信号转导通路中的一种病毒拦截器干扰Grb2介导的信号通路。
HCV感染对细胞信号级联的影响在HCC发生中的作用国内外尚未见文献报道。本课
题组及其 他学者的研究结果显示HCVN S3和HCV NS5蛋白均定位于细胞浆，它们不可能
与核内蛋白和 DNA直接结合引起基因表达，故推测它们可能是通过影响细胞信号级联使细
胞发生恶性转化。
鉴于既往研究结果，本课题利用分子生物学和细胞培养技术从细胞信号转导通路的角

-3-1-

度研究HCV NS3和HCV NS5蛋白对细胞信号转导通路的影响及细胞的转化作用。主要探
讨：① HCV两种非结构蛋白对MAPK和JAKSTAT3信号通路影响；② HCV NS3和HCV
NS5主要是影响级联的哪个环节；③ HCV NS3和HCV NS5两种蛋白究竟哪种对信号转导
通路的影响效用强。本课题的研究可望对HCV致癌机制有一个比较合理的阐述，并为临床
防治 HCV所致HCC提供理论依据。
本课题是两个卫生部课题（94-120和 98-1-110）研究的延续，为本课题的研究打下了一
定的基础，并做了如下工作：① 观察到HCV NS3蛋白在HCC发生中起重要作用；② 利用
逆转录PCR对HCC组织中HCV的基因型进行了研究；③ 利用原位杂交检测了HCV RNA
在HCC和癌旁肝组织中的定位和分布；④ 利用原位逆转录方法检测了HCC和癌旁肝组织中端粒酶的活性，并在方法学上进行了改进；⑤利用分子生物学和细胞培养技术研究了HCV
NS3基因转染NIH3T3细胞后细胞端粒酶活性的变化；⑥HCV E1，E2NS1，NS5蛋白基因
在大肠杆菌内表达的实验研究；⑦1999年本课题组与美国New England Biolab合作研究了
MAPK信号转导通路的异常与乳腺癌和肝细胞癌发生的关系。

参考文献
1. Sakamuro D, et al. Hepatitis C virus nonstructural protein NS
3
transformsNIH3T3 cells. J
Virol,1995,69(6):3893
2. 冯德云，等. 肝癌发生中丙型肝炎病毒NS
3
蛋白对p53 基因蛋白表达的影响。中华医学
杂志，1998，78（4）：278
3. 冯德云，等. 肝细胞癌与癌旁肝组织中HCV RNA原位分子杂交和HBsAg 免疫组化研
究。中华病理学杂志，1998，27（3）：220
4. 冯德云，等. 湖南 地区丙型肝炎病毒基因型在肝细胞癌组织中的分布。湖南医科大学学
报，1998，23（3）：232
5. 刘双虎，等, 丙型肝炎病毒E1，E2NS1，NS5蛋白基因在大肠杆菌内的表达及其产物的
初步应用。中华传染病学杂志，1998，16（1）：
6. 刘双虎，等. 丙型肝炎病毒 NS
5
基因片段的克隆与表达。湖南医科大学学报，1996，21
（3）：242
7. Jain N, et al. Repression of Stat3 activity activation of mitogen-activated protein kinase
(MAPK). Oncogen, 1998, 17(24): 3157Leaman DW, et al. Roles of JAKs in activation of
STATs and stimulation of c-fos gene expression by epidermal growth factor. Mol Cell Biol,
1996, 16(1): 369
8. Chung J,. STAT3 serine phosphorylation by ERK-dependent and -independent pathways
negatively modulates its tyrosine phosphorylation. Mol Cell Biol, 1997, 17(11): 6508
9. Ihle JN,et al STATs: signal transducers and activators of transcription. Cell, 1996, 84(3): 331
10. You LR, et al Hepatitis C virus core protein enhances NF-κB signal pathway triggering by
lymphotoxin-β receptor ligand and tumor necrosis factor alpha. J Virol, 1999, 73(2):1672-81
11. Tsuchihara K, et al. Hepatitis C virus core protein regulates cell growth and signal
transduction pathway transmitting growth stimuli. Virology, 1999, 258: 100
12. Heim MH, et al. Expression of hepatitis C virus proteins inhibits signal transduction through
the Jak-STAT pathway. J Virol, 1999, 73(2): 8469
13. Borowski P, et al. Nonstructural protein 3 of hepatitis C virus blocks the distribution of the
free catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase. J Virol, 1997, 71(4): 2838
14. Tan SL, et al. NS5, a nonstructural protein of hepatitis C virus, binds growth factor
receptor-bound protein 2 adaptor protein in a src homology 3 domainligand- dependent
manner and perturbs mitogenic signaling. Proc Natl Acad Sic USA, 1999, 96:5533


-3-2-

三、 研究方案
1． 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

本课题的研究是以以下假说为依据：HCV感染机 体后，病毒通过其表达的蛋白质，特别
是HCVNS
3
和HCVNS
5
蛋白引起细胞信号转导通路MAPK和JAKSTAT3级联的异常，激活
癌基因和端粒酶，导致细胞 恶性转化。

研究内容
构建HCV NS3和HCV NS5表达质粒并用它们分 别和联合转染NIH3T3细胞。①观察
细胞的转化和成瘤性；②检测MAPK和JAKSTAT3信号 转导通路各级联成分的改变；③检
测立早癌基因c-foc、c-jun和egr-1等的表达；④检测 癌基因ras、myc和src的激活情况；⑤
利用TRAP-PCR检测端粒酶活性的改变。

研究目标

通过上述研究从下列几个方面探讨HCV的致癌机制，并为临床防治HCC提供理论依
据。
① HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH3T3细胞后是否导致MAPK和JAKSTAT 3
信号转导通路的异常改变；
② HCV NS3和NS5主要是影响级联的哪个环节；
③ HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH3T3细胞是否导致立早癌基因和癌基因的
异常激活。
④ HCVNS3和HCVNS5表达质粒转染NIH3T3细胞是否导致端粒酶活性的升高。
⑤ 转化的NIH3T3细胞接种裸鼠后生成肿瘤的机率有多大，其组织学形态有何改变；

拟解决的关键问题

在理论上拟解决的关键问题是：
① HCV可能是通过 其表达的蛋白质，特别是HCVNS3和HCVNS5导致细胞信号转导
通路的异常、癌基因的异常激活 和端粒酶活性增高，最终使发生细胞恶性转化；
② HCVNS
3
和HCVNS5
导致细胞信号转导通路的异常是细胞恶性转化的前提和条件。
③ 利用NS3和NS5 表达质粒转染NIH3T3细胞从细胞信号转导角度探讨HCV致癌机
制，可望在一定程度上解决由于H CV致癌动物模型难以复制，限制HCV致癌机制
研究的问题。


在技术上拟解决的关键问题是：
① 保证各实验组间的平行性和资料的可比性；
② 避免NIH3T3细胞的自身转化；


-4-

2．拟采用的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 按
Sakamuro等和我们的方法分别构建HCVNS
3
和HCVNS
5
表达质粒pRcHCNS3-5’（nt
3354-4210）和PMAL-CRI- NS5（nt 6625-7027），转染NIH3T3细胞，观察细胞的转化情况，
分离细胞胞浆和 胞核并利用Western blot方法检测转染和不转染的NIH3T3胞浆和胞核中
MAPK、S TAT3的磷酸化状况；利用Northern blot方法检测转染和不转染的NIH3T3细胞立
早癌基因c- jun、c-fos、egr-1和癌基因基因ras、myc和src的激活情况；利用TRAP-PCR检< br>测端粒酶活性的改变；用转染的NIH3T3细胞接种裸鼠观察肿瘤生成情况，并用HepG2细
胞株作阳性对照，采用不转染的NIH3T3细胞作平行实验，以保证方法学上的可比性和排除
NIH3 T3细胞自身转化的可能。在实验中，我们还将利用HCV NS3和HCV NS5反义DNA
经脂质体转染入上述已转化的NIH3T3细胞，然后再检测上述已列出的指标。

技术路线

分别构建


HCVNS3表达质粒pRcHCNS3-5’ HCVNS5表达质粒PMAL-CRI-NS5
HepG2细胞株


联合 转染

转染
转染
阳性 对照


NIH3T3细胞

反义HCV NS3和或

接种裸鼠观察成瘤性

HCV NS5 核苷酸

转 染

转染的NIH3T3细胞 NIH3T3细胞



检测NS3和NS5蛋白表达

Western blot
TRAP-PCR
Northern blot

端的检和胞

粒激测浆

酶活立和

活和早胞

性表癌
磷
核

的达基
酸

变因
化

化
STA
T3
MAPK






研究方法和可行性分析


① 本课题采用的分子生物学、细胞培养、免疫学及检测端粒酶活性的TRAP- PCR等技术已
熟练掌握，并利用上述技术做了大量工作（见研究基础）。
②
本课题组已完成了HCVNS3 和HCVNS5表达质粒（pRcHCNS3-5’，PMAL-CRI- NS5）
的构建，为本课题的完成创造了首要条件。

③
近年，美国New England Biolab已研制了检测MAKK和Stat3磷酸化的抗体phospho-



-5-1-

p4442MAP kinase(Erk1Erk2)(Thr202Tyr204)、phospho-p38MAP kinase(Thr108Tyr182)、
phospho-stat3(Tyr705)和 phospho-stat3(Ser727)，故利用Western blot或免疫组化即可检测
MAPK和Stat3的磷酸化。特别是本课题组与其合作，进行了MAPK和STAT3磷酸化在
乳腺 癌和肝细胞癌发生过程中的作用，并获得满意的结果。
④ 硫代磷酸脂修饰的HCV NS3和HCV NS5反义寡核苷酸参照文献（Takamizawa A, et al. J
Virology, 1991, 65: 1105）序列，由美国辛辛拉提大学DNA中心为我们有偿合成制备。
⑤ 大 部分试剂国内公司有购；检测MAKP（Erk1Erk2，p38）和STAT3磷酸化的试剂盒可
由 美国New England Biolab有偿提供；脂质体lipofectin可从Sigma公司购得； 细胞株
NIH3T3（购自美国ATCC公司）和HepG2本室有现货。
⑥ 上两个卫生部课题的研究为本项目的完成打下了一定的基础。
⑦ 我们认为实验方案中的单项操作是不 困难的，但本项目分组和检测指标较多，如何保证实
验资料的可比性和研究结果的科学性，是必须认真对 待的问题。此外，在实验过程中应排
除NIH3T3细胞自身转化对结果的影响，为此，本课题组采用的 NIH3T3细胞是来自美
国ATCC公司，该细胞自身转化率低，并在实验操作中作了如下安排和处理 。
（1）细胞转染实验：采用同一批解冻的NIH3T3细胞在相同的条件下用HCV NS3表达
质粒pRcHCNS3-5’和PMAL-CRI-NS5单独联合转染NIH3T3细胞， 在选择性琼脂
培基上培养，并挑选阳性克隆，再经Southern blot技术进一步鉴定阳性克隆确实是
有HCV NS3表达质粒转染的NIH3T3细胞；然后接种 与液体培养基中培养。每组
接种8瓶（共24瓶）。以空白质粒转染作阴性对照；用8瓶NIH3T3细 胞作平行实
验。
（2）转染细胞的成瘤性检测：上述转染阳性的NIH3T3细胞、作平行实 验实验的NIH3T3
细胞和HepG2细胞株，经过相同的传代次数后接种裸鼠，观察成瘤性。
（3）HCV NS3、HCV NS5蛋白的表达和MAPK和Stat3磷酸化检测：：分别从24 瓶转染
阳性的NIH3T3细胞和8瓶作平行实验实验的NIH3T3细胞内抽提蛋白质，点样在
同一尼龙膜上（18张），电泳后分别用抗HCV NS3和HCV NS5抗体及检测MAPK
和Stat3磷酸化的抗体phospho-p4442MAP kinase(Erk1Erk2)(Thr202Tyr204),
phospho-p38MAP kinase(Thr108Tyr182)、phospho-stat3(Tyr705)和
phospho-stat3(Ser727)进行western blot，分别检测HCV NS3、HCV NS5蛋白的表达
及MAPK（Erk1Erk2、p38）和Stat3的磷酸化， 重复3次（每次用点样尼龙膜6张，
共18张），然后利用计算机图象处理系统分析其光密度。
（4）立早癌基因c-jun、c-fos、egr-1和癌基因基因ras、myc和src的RNA 检测：分别从
24瓶转染阳性的NIH3T3细胞和8瓶作平行实验实验的NIH3T3细胞内抽提RN A，
点样在同一尼龙膜上，先后与c-jun、c-fos、egr-1、ras、myc和src rRNA探针杂交
（Northern blot），重复3次。
（5）检测端粒酶活性的变化：取（4）抽提的部分RNA，用TRAP-PCR检测转染阳性的
NIH3T3细胞和作平行实验实验的NIH3T3细胞端粒酶活性的变化，重复3次。
（6）反义寡核苷酸转染及其指标的检测：取上述pRcHCNS3-5’和PMAL-CRI- NS5转染
的阳性性细胞，再用HCV NS3和HCV NS5反义寡核苷酸转染。然后上述方法检测
上述指标（2）~（5）。
（7）指标分由3人专职检测；操作（3）、（4）、（5）、（6）同时进行。
（8）项目组进行过类似的多组、多因素实验，熟练掌握此类实验的设计方案。


-5-2-

2． 本项目的创新之处

① 本项目从细胞信号转导的角度探讨HCV的致癌机制。
② MAPK和STAT3信号转导通路是两条主要的信号通路，HCV NS3和HCV NS5
蛋白是与 HCC发生密切相关的两种HCV非结构蛋白，本课题选择NS3和
NS5蛋白对两条信号转导通路的影 响，以探讨HCV的致癌机制，具有新意。
③ 由于HCV致癌动物模型难以复制，限制了HCV致癌 机制的研究。本课题利
用NS
3
和NS
5
表达质粒转染NIH3T3 细胞，并使细胞转化。将为HCV的致癌
机制提供较直接的依据，并建立HCV致癌机制的新模型。



-5-3-

4．年度研究计划及预期进展


2001年01月——2001年12月
① 用HCVNS
3
和HCVNS
5
表达质粒转染NIH3T3细胞。
② 检测转染后的NIH3T3细胞的HCV NS3和HCV NS5蛋白的表达。
③ 用质粒转染后的NIH3T3细胞接种裸鼠，观察肿瘤生成状况。
④ 检测MAPK和STAT3磷酸化。


2002年01月——2002年12月

① 检测立早癌基因和癌基因的激活状况。
② 检测端粒酶的活性变化。
③ 用HCV NS3和HCV NS5反义DNA转染已转化的NIH3T3细胞。


2003年01月——2003年06月

① 检测经HCV NS3和HCV NS5反义DNA转染后的转化NIH3T3细胞的上述各指标
的改变。


2003年07月——2003年12月
① 总结资料、撰写论文，必要时补充部分实验。





5．预期研究成果

预计可获得下述两方面的成果
理论上：
① 验证HCV非结构蛋白的致癌机制可能是通过其影响MAPK和JAKSTAT3细胞信号
转导通路，使 癌基因异常激活和端粒酶激活等，导致细胞恶性转化。
② 为初步验证HCVNS3和HCV NS5反义DNA具有抑制MAPK和JAKSTAT3信号转
导通路提供新的实验资料。
③ 为临床防治HCC提供理论依据和新思路。

人才培养：本项目可以培养2名硕士研究生。

研究成果以论文形式提供，预计在国际和国内核心期刊分别发表1篇和3篇论文，争 取
有2-3篇摘要参加国际学术会议。


-6-

四、研究基础

1． 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩
本课题组自80年代一直从事肝炎、肝硬变和肝 癌方面的研究，曾获2项国家自然科学基金
（编号：3860608，3880377），对该领域的研 究进展和动态较清楚。在研究过程中建立了一
套完整的实验方法和装备较好的实验室，并培养了一批素质 较高的研究人员。本课题组与美
国New England Biolab合作进行了MAPK和STA T3磷酸化在乳腺癌和肝细胞癌发生中的作
用，特别是本课题组1994年和1998年两次获卫生部课 题[“丙型肝炎病毒变异在肝细胞癌
发病机制中的作用”（94-120）；“丙型肝炎病毒表达的蛋白 对端粒酶激活与肝癌发生的关
系”（98-1-110）]，为该课题的完成奠定了基础，本课题亦是上 述课题的进一步深入。值得
一提的是本课题组已成功地构建了HCVNS
5
和HCVN S
5
表达质粒pRcHCNS3-5’和
PMAL-CRI- NS5，为本课题的完成作了方法上和材料上的准备。














2． 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部
门开放实验室的计划与落实情况）

① 本教研室拥有装备较先进的分子生物学实验室、免疫 组化室、同位素室、细胞培养
室。主要仪器有：双板PCR仪（Ericomp，USA）；CO
2
培养箱（日本产）；超低温冰
箱（USA）；日立H-600电镜；水浴摇床；超速低温离 心机；紫外分光光度计；酶标
分光光度计；杂交炉；图像分析仪；电子天平等。
② 本课题组有合理的梯队，科室领导十分重视科研，主要成员均学有所长。
③ 与国外学者保持有良好的合作关系。



-7-

-8-2-

五、 经费预算

支出科目
1．合计
（1）科研业务费

（2）实验材料费









（3）仪器设备费

（4）实验室改装费
（5）项目组织实施费






















金额
（万元）
18.0
1.0

14.3









1.2

0.5
1.0






















计算根据及理由

论文发表，学术会议，资料检索，复印和打印，幻灯
片和胶片制作等。
细胞培养试剂（培养基，小牛血清，蛋白酶）1.8万
元；HCV NS3和HCV NS5蛋白检测试剂盒0.6万元；
HCV NS3和HCV NS5反义DNA合成1.4万元；Lipo-
fectin 0.9万元；MAPK和STAT3磷酸化检测试剂盒
1.2万元；端粒酶活性检测试剂盒0.9万元；Western
blot试剂盒0.8万元；Nrothern blot试剂盒及检测癌
基因表达的cDNA探针1.8万元；抗癌基因产物的
抗体及检测试剂1.1万元；裸鼠及饲料1.2万元；测
试分析(校测试中心低温超速离心，电泳结果的光密
度测定等均需交费)1.1万元；其它消耗品1.5万元。
超纯水装置0.8万元，pipettman×3（1000μl，20μl，
2μl）0.4万元。
暗室改装

注：预算支出科目按下列顺序填写：1. 科研业务费 2. 实验材料费 3. 仪器设备费 4.实验室改装费
5. 协作费 6. 项目组织实施费。开支范围详见《国家自然科学基金资助项目财务管理办法》第二章。
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六、 申请者正在承担的其它研究项目
（攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起
止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况）
名称 编号 任务来源 起止年月 负责或参加

丙型肝炎病毒表达的蛋白对端
98-1-110 卫生部 1998.12-2000.12 负责
粒酶激活与肝癌发生的关系

本 项目是上述课题研究的延续,上述课题只从HCVNS
3
蛋白可能对端粒酶具有激
活作 用的角度探讨HCV的致癌机制，并已获得预期的结果，部分论文已在国内
核心期刊上发表，为本项目的 完成作了理论上和方法上的准备。本课题将从
HCVNS
3
和HCVNS
5
蛋白可能是使细胞信号转导通路异常，激活立早癌基因和
癌基因或和使抑癌基因失活，导致细胞 恶性转化。


七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况
批准号 项目名称 起止年月 负责或参加 进展或完成情况

86030608

3880377
胶原分型与慢性肝
炎、肝硬化发病机制

乙型病毒性肝炎
HBVDNA原位杂交
及免疫电镜研究
1987．01-
1989．12


1989．01-
1991．12


主要研究者



主要研究者
已完成











已完成

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对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目(项目名称及批号)完成情况、后
续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附已结题项目《研究工作总结摘
要》（300字）及已发表主要相关论文首页复印件（限三篇）。

八、申请者承诺
我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守过家自然
科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送
有关材料。

申请者（签章）
年 月 日
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九、推荐意见
(不具备有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。
推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究
条件等。项目组成员不能做推荐者)


















推荐者（签章） 专业技术职务 专长


所在单位：
















推荐者（签章） 专业技术职务 专长


所在单位：



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十、申请者所在单位及合作单位的审查与保证
1． 申请者所在单位学术委员会的审查意见（包括：对项目的意义、特色和创新之处及申请
者的研究水平与学风签署具体意见）

本课题利用分子生物学、细胞培养及免疫学等 技术从HCVNS
3
和HCVNS
5
蛋白对细胞信号转导通路影响的角度较系 统地研究HCV非结构蛋白的致癌机
制。立论依据充分，设计思路新颖，研究手段先进，研究目标明确， 技术路线清
晰。该课题的研究将为阐明HCV的致癌机制提供较直接证据，并为临床防治
HCC 提供理论依据。
申请者曾多次参加国家自然科学基金资助项目的研究，并2次获卫生部课
题， 多年来肝脏疾病的研究，具有良好的科研素质，较高的理论水平及熟练的实
验技能。经学校学术委员会审 查，同意该项目申请国家自然科学基金，建议基金
委予以资助。




























主任或副主任（签章） 年 月 日



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2． 合作单位的审查意见与保证
同意参加合作研究，保证对参加合作研究人员时间及工作条件的支持、督促其按计划
完成所承担的任务（及需要说明的其它问题）
















合作单位1（公章）

3． 申请者所在单位领导的审查意见与保证
已按填报说明对申请人进行了资格审查，对申请书内容进行了审核，同意学术委员会
的审查意见，并保证在项目获得资助后做到以下几点：
(1) 保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持。
(2) 严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理、财务等各项规定。
(3) 督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报
表和材料。












单位负责人（签章） 单位（公章） 年 月 日
















合作单位2（公章）
















合作单位3（公章）



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