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RT-PCR实验设计方案


一、试剂及实验材料准备
PCR管；1mL、200 µL 、20 µL（枪头）；1.5 mL；2.0 mL（离心管）；镊子；
无菌水（用0.1%DEPC处理）。
以上材料均需置于盛有0.1 %DEPC溶液的小桶中浸泡过夜（至少24小时），
再置于灭菌锅121℃高压下灭菌30min以除 去RNA酶。

二、实验步骤：
总RNA提取：
1. 取植物叶片组织 （或根组织）适量置于已用液氮遇冷处理的研钵中，加
液氮用研杵迅速研磨组织，直至磨成粉末状（离心 机提前4℃预冷）；
2. 向研钵中加入1-2ml（适量）的RNAiso
TM
Plus提取液，继续研磨样品至
裂解液呈透明状；
3. 将匀浆液转移至2ml离心管，室温静置5min； 12000g，离心5min；
4. 小心吸取 上清液，移至新的2ml离心管，加入15体积（相对于加入2ml
离心管的上清液）的氯仿，剧烈振荡 15s，待溶液充分乳化至无分相时，
室温静置5min，12000g离心15min；
5. 小心取出离心管（此时离心管分三层），小心吸取上清液至另一新的2ml
离心管（注意 不要吸入中间蛋白质层）；
6. 重复4、5两步
7. 向上清液中加入等体积的异丙醇， 颠倒充分混匀后，在15-30℃（常温）
下静置10min；12000g，离心10min，离心管 底部出现沉淀；
8. 用75%预冷的乙醇洗涤沉淀2次，7500rpm，4min。凉干一段时间 后，用
DEPC处理无菌水溶解沉淀，60℃ 水浴10min，得模板RNA（比色测纯度）。

三、RNA定量
将得到的模板RNA用DEPC处理无菌水溶解后，进行定量。

1

a) 首先打开分光光度计，软件界面选择核酸测量，空白组用 DEPC处理无菌
水，1连池，空白结束后，测量RNA含量；
b) 取RNA样品40ul ，用DEPC处理无菌水补齐至4000ul，即稀释100倍，
测得实验数据，分别记录以下数据：2 30.0nm；260.0nm；280.0nm；
A260A230；A260A280

RNA纯度鉴定标准：
 OD260OD280值在1.9-2.1之间，RNA的纯度较好；
 OD260OD280值小于1.8，表明蛋白杂质较多；
 OD260OD280值大于2.2，表明RNA已经降解

逆转录RNA取样量的计算：
 计算样品浓度（µgµl）= A
260
数值×稀释倍数（100）×401000；
 根据样品浓度计算逆转录所需RNA量（根据实验经验，RNA总量为0.85µg时
结果最佳。因此，由样品浓度（µgµl）×逆转录所需RNA量（µl）=0.85µg

四、RT-PCR
4.1 RT过程：
试剂准备(TaKaRa)：
x：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP （10mM each）
6 mers（20um）
3. RNA模板
4. DEPC处理无菌水

4.2操作步骤
4.2.1反转录反应：按以下次序将各成分加入一无菌PCR管中。
dNTPmix 1ul
Random 6 mers 2ul
RNA模板 x（根据定量结果确定）
ddH
2
O

2
补齐至10ul

4.2.2短暂离心后，PCR仪上变性退火反应
1) 65℃ 5min
2) 冰上速冷 pause
4.2.3在上述离心管中配制下列反应液：
5×PrimeScriptTM buffer 4ul
RNase Inhibiter 0.5ul
PrimeScriptTM RTase 1ul
ddH
2
O 4.5ul
4.2.4短暂离心（离心力？）后，PCR仪上反应：
30℃ 10min
42-50℃ 30-60min
70℃ 15min
4℃ pause
得到cDNA,-35℃保存；
4.2 PCR过程：
试剂准备（生工产品）:
 cDNA模版;
 目的基因引物;
 10×PCR Buffer;
 Taq酶;
 Mg
2+

 dNTPs mix

操作步骤
按以下顺序将各成分加入一无菌PCR管中:
 10×PCR buffer 2.5 μl
 引物1 0.5μl
 引物2 0.5μl
 Mg
2+
3.0 ul

3

 Taq酶 0.5μl
 dNTPmix 0.5 ul
 cDNA模版 yμl(最后加入)
 加ddH
2
O至 25ul(最后加入)
Note: 先计算除cDNA模版和ddH
2
O之外所需各组份的总量（例如3管， 各组份则×3.2
左右），小心分装后，每管再添加yμL的cDNA模版，以及对应体积的ddH2
O。

短暂离心后，PCR仪上反应：
 95℃ 5min
 95℃ 30 s
 根据引物Tm值 30 s
 72℃ 60 s
 72℃ 10 min
 4℃ pause

五、PCR的电泳检测：
 每PCR管加入上样缓冲液5ul,轻轻混匀；
 应用1%琼脂糖凝胶电泳监测PCR结果；
 电泳条件：80V 10min, 100V 20min.
50×TAE Buffer 配制方法：
1. 称量Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g 于1L烧杯中；
2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；
3加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；
4.加去离子水定容至1L后，室温保存
我想不通的是在配50X的储液的时候为什么只加57.1m l的乙酸呢？而不是
114.2ml呢

附：
试剂的相对分子量：Tris（121.14）、乙酸（60.05）、EDTA（292.25）、
EDTA-Na2（336.21） 、Na2EDTA·2H2O （372.21）
冰乙酸的密度：1.049gml

先配50*的TAE：
称下列试剂加入到1L烧杯中：tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g，然后 加入800ml
的去离子水，充分搅拌溶解。加入57.1ml的醋酸，充分混匀。加去离子水定容至1L，室温保存。

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需要使用的时候，稀释为 1*的，例如：需要使用200ml的1*TAE，则量4ml的
50*TAE，196ml的去离子水 ，混匀即可。



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