西安铁路学院-钓鱼作文

实验一 凝集试验

颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结 合后，在有适量电解质存在
下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglut ination reaction)
或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutin ogen），抗体称为凝集素
（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负 电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状
态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原 抗体复合物，降低了抗原
分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下， 由于
离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排
斥力， 分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据
是否出现凝集反应及其程度 ，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反
应。
[目的要求]
1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。
2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。
[材料与试剂]
1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加
样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原， 布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板
凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清， 被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]
（一）试管凝集试验
以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血 清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试

管架上。如被检血清有多份，对 照只需做1份。
2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加
入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml ，
加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，
混匀后吸取0.5 ml 加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml （见表1-1）。
该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。
3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5 ml ，第6管加1:25稀
释的布氏杆菌病阳性血清0.5 ml ，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5
ml 。
4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，
每支试管加0.5 ml 。
表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）
试 管 号

最终血清稀释度

0.5%石炭酸生理盐水
被检血清
抗原(1：20)
1

1：25

2.3
0.2
0.5
2

1：50

0.5
0.5
0.5
3

1：100

0.5
0.5
0.5
4

1：200
抗 原

0.5
0.5
0.5
0.5

0.5
1：25

0.5
0.5
1：25

0.5
0.5
5 6
对 照 管
阳性血清 阴性血清
7
弃1.5 弃0.5

5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取
出后 置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24
h取出），然后观察并记录结果。
6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根 据各管中上清液的透明度、
抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。
＋＋ ＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，
振荡时，沉淀物呈片状、 块状或颗粒状。
＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。
＋＋：50％抗原凝集， 上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显

的凝集）。
＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。
－：抗原完 全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底
中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡 后立即散开呈均匀混浊。
7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称
滴度）。
牛、马和骆驼的血清凝集价大 于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑
似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清 凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25
的凝集价判为疑似反应（可疑）。
[注意事项]
1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结
果。
2. 结果判 为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判
为阳性。对同群中既无临床症状又 无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；
牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合 反应核对。
（二）布氏杆菌病平板凝集试验
1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方 格（4cm），并注明被检血清号码，
以100L微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l 格80L、第2格40L、
第3格20L、第4格10L。血清用前需放室温，使其温度达20 ℃左右。每一份检样
需换一个tip头。
大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40L 和20L ；
猪、山羊、绵羊、狗用80L和40L。
2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗 原30L，滴在血清附近，而不与血清
接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份 血清用一根牙签。
抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。
3. 作用：混和完毕 后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达
到30℃左右，3-5min内记录反应结果 。
4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。
5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。
＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。
2

＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。
＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。
＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。
－：液体均匀混浊，无凝集现象。
6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。
表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系
平 板 凝 集
相当于试管凝集
80L
1:25
40L
1:50
20L
1:100
10L
1:200

7. 判定标准：同试管凝集试验。
8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。
（三）虎红平板凝集试验
这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平 板凝集试验
可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。
1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30L滴于玻璃板的方格内，每份
血清各用 一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20℃）4-10min内记录反应结果。同
时以阳、阴性血清作 对照。
2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任
何 程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。
3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行
试验。
（四）鸡白痢平板凝集试验
1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30L）滴 于玻板或载玻片上，
用牙签或火柴棒充分混合。
2. 结果判定：在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴
性。

[思考题]
1. 凝集反应的原理是什么?
2. 哪些因素影响细菌凝集试验?
3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？

实验二 病毒的血凝及血凝抑制试验

有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血 凝，利用这种特性
设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异 性
的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)
试验 ，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病
毒来检查被检血清中 的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]
掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]
1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。
2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]
（一）血球凝集(HA)试验
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50L病毒 液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50L
至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50 L；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温
下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：L）
孔 号
病毒稀释度
生理盐水
病毒液
1
1:2
50
50
2
1:4
50
50
50
3
1:8
50
50
50
4 5 6 7 8 9 10 11 12
1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50 50
弃50
50
0.5%红细胞 50
结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + + - -

4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行
结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不
凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀 释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1
看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则 l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分
别为2、4个血凝单位，或将1284=32，即1 :32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验
1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11
孔各加50L生理盐水。
3. 第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀
释至第 10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 „„ ；第12孔加新城
疫阳性血清50L，作为血清对照。
4. 自第1孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4
单位新城疫病毒液对 照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置
后观察结果（表4-2）。
表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）
孔 号
血清稀
释度
生理盐
水
被检鸡
血清
4单位病
毒
室温中静置 10 min
0.5%红细
胞
弃去50
结果观
察
- - - - - - + ++ +++ ++++ ++++ -
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
1
1:2
50
50
50
2
1:4
50
50
50
3 4 5 6 7 8 9 10 11
病毒
对照
50

50
12
血清
对照

50
50
1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50

6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔） 出现红细胞100%凝集（++++），而血清
对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结 果观察。

以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑 制效
价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
从表4- 2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即
6log2。

附 录
1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液
枸橼酸钠（5H
2
O） 0.80g
枸橼酸（H
2
O） 0.055g
葡萄糖 2.05g
氯化钠 0.42g
双蒸水 加至 100 ml
将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃ 保存备
用。
2. 0.5% 鸡红细胞制备方法
先用灭菌注射器吸取3.8% 枸 橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉
或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌 生理盐水为抗凝血的2倍，以
2000rmin离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同 上法离心沉淀，如此
将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 96孔微量反应板的清洗
将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应 板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应
板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。

[思考题]
1. HA和HI试验的原理是什么？
2. HI试验是不是特异的抗原抗体反应，为什么?
3. HA和HI试验有何实际应用意义？