双向琼脂扩散实验
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双向琼脂扩散试验
一、实验目的
1、掌握双向琼扩试验的原理和用途
2、掌握双向琼扩试验操作方法
3、观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线
二、原理
血清学反应：
• 凝集反应
• 沉淀反应
•
补体参与的反应
• 中和反应
凝集反应：
颗粒性抗原，或吸附在颗粒性载体表面的
可溶性性抗原，与相应抗体结合，
在有适当电解质存在，
经过一定时间，成肉眼可见的凝集团块
参与凝集反应的抗
原称凝集原，抗体称为凝集素
沉淀反应：将可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存
在条件下，即可形成肉眼可见的沉淀物
沉淀物只在抗原抗
体比例合适时才出现
补体参与的反应：
补体结合试验是根据补体能与任何
抗原抗体复合物结合，但不能单独同抗原或
抗体结合的特
性，用特定的补体来检测抗原抗体间有无特异性结合
中和反应：针
对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗
体与病毒结合后可以中和病毒的感染性（
病毒中和试验可
以在细胞培养、鸡胚或 动物上进行，一般将抗体作稀释，
与一定量的病毒混合
，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物
上的残余感染性）•
终点是以抑制细胞病变（细胞培养）
或 病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。
（ 中和试验具有很强的特异性，是检测病中和试验具有很
强的特异性，
毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，
也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体）
双向琼脂扩散
试验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小
孔中。 两者相互扩散
，当扩散到他们的浓度比例合适的部
位相遇时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀【可溶性抗原（如
蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）
与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者
相遇，在比例合
适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔
中，两者各自向四周扩
散，如两者相对应，浓度比例合适，
则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色
沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若
同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度
的不同，可在
琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定
两种抗原是完全相同还
是部分相同。所以，可用此法来分析
和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体
的效价。】
三、实验材料
Ag （实验所提供的抗原）
Ab（实验所提供的抗体 血清）
1%琼脂
玻片、打孔器、加样器、tip头等
四、步骤
1、 称取1g琼脂粉，加至100ml
8%高渗盐水中，配制1%
琼脂凝胶隔水煮沸使其溶化 稍冷至55℃后浇板
(用吸管
吸取4ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板）注意载玻片应放
水平，琼脂勿倒出板外。
2、 待凝固后在琼脂上打梅花孔（孔数 孔径 孔距
根据实
验情况待定）孔内的琼脂如未吸出 ，则用注射器针头挑出
孔中琼脂。
3、封底：将玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以
不烫手为宜），使琼脂与玻片紧贴；
将抗体按二倍比稀释法稀释成1:2，1:4，1:8，1:16，1:32 ，
中间孔加抗
原，周围孔加倍比稀释抗体，其中一个孔加滴入
生理盐水作为对照（小心加样，不要溢出）
4、置37 ℃湿盒24-48h
结果观察：在抗原抗体比例合适处，出现白色沉淀，以出
现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。