小学生演讲稿-感恩祖国手抄报

生物化学实验指导

电子版
















1

实验一 糖类的颜色反应 .... .................................................. .................................................. ....... 3
实验二 糖类的还原作用 ....................... .................................................. ...................................... 4
实验三 蛋白质的颜色反应 ......................................... .................................................. ................ 6
实验四 蛋白质的沉淀反应 ............. .................................................. ............................................ 9
实验五 蛋白质等电点测定 ................................ .................................................. ....................... 11
实验六 酪蛋白的制备——等电点沉淀法 .................................................. ............................... 12
实验七 氨基酸的纸层析 .......................................... .................................................. ................. 14
实验八 电泳技术——纸电泳分离氨基酸 ..... .................................................. .......................... 16
实验九 酶的催化特性 .... .................................................. .................................................. ......... 20
实验十 糖化酶活力测定 .................... .................................................. ....................................... 23
实验十一 从酵母提取核糖核酸——稀碱法 .......................... .................................................. ... 25
实验十二 从酵母提取核糖核酸——浓盐法 ................... .................................................. .......... 26
实验十三 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 ............ .................................................. ................. 29
实验十四 醋酸纤维薄膜电泳 ........... .................................................. .......................................... 30

2

实验一 糖类的颜色反应
一、实验目的
1．了解糖类某些颜色反应的原理。
2．学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。
二、实验原理
1.α-萘酚反应（Molisch反应）原理
糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与α-萘酚
生成紫红 色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反
应。

2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）原理
在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛 ，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反
应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只 有在糖浓度较高或煮沸时间较
长时，才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。
三、器材
1.试管及试管架 2.滴管
3.水浴锅
四、试剂
1.莫氏（Molisch）试剂： 5% α-萘酚的酒精溶液，称取α- 萘酚5g，溶于95%酒精中，
并用此酒精使总体积达100mL，贮于棕色瓶内。此试剂需新鲜配制。
2.塞氏（Seliwanoff）试剂：称取间苯二酚0.05g溶于30 mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀
释至100 mL，此试剂需新鲜配制。
3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
3

4.1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
5.1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
6.1%淀粉溶液：称取可溶 性淀粉1g与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入
沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释 至100mL。
7.0.1%糠醛溶液：称取糠醛0.1g，溶于100mL蒸馏水中。
8.浓硫酸 500mL
五、操作
1.α-萘酚反应（Molisch反应） < br>取5支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、
0.1% 糠醛溶液各1.5mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。斜执试管，沿
管壁慢慢加入浓 硫酸约1mL，慢慢立起试管，切勿摇动。浓硫酸在试液下形成两层。在二
液分界处有紫红色环出现。观 察、记录各管颜色。
试剂
1%葡萄糖溶液
1%果糖溶液
1%蔗糖溶液
1%淀粉溶液
0.1%糠醛溶液
现象





解释现象





2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）
取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1 %果糖溶液、1%蔗糖溶液各5mL。再向各管
分别加入塞氏试剂2mL，混匀。将3支试管同时放入沸 水浴中，注意观察、记录各管颜色
的变化及变化时间。
六、思考题
1．可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？
2．α-萘酚反应的原理是什么？
实验二 糖类的还原作用
一、实验目的
学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。
二、实验原理
许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，故在碱性溶液中能将铜 、铋、
汞、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被
利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。
本实验进行糖类的还原作用所用的试剂为斐林试剂和本尼 迪克特试剂。它们都是含
Cu
2+
的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色或 黄色的Cu
2
O沉淀。生成Cu
2
O沉
淀的颜色之所以不同是由于在 不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的，颗粒越小呈黄
4

色，越大则呈红色。如有保护性胶体存在时，常生成黄色沉淀。
三、器材
1．试管及试管架
2．竹试管夹
3．水浴锅
4．电炉
四、试剂
1．斐林（Fehling）试剂
菲林甲液（硫酸酮溶液）：称取34. 5g硫酸铜（CuSO
4
·5H
2
O）溶于500mL蒸馏水中。
菲林乙液（碱性酒石酸盐溶液）：称取125g氢氧化钠和137g洒石酸钾钠溶于500 mL
蒸馏水中。
为了避免变质，甲、乙二液分开保存。用前，将甲、乙二液等量混合即可。
2．本尼迪克特（Benedict）试剂
称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na
2
CO
3
·H
2
O）100 g加入600mL蒸馏水中，加热使其
溶解，冷却，稀释至850mL。
另称取17.3g硫酸铜溶解于100 mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。
最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠- 碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有
沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。
3．1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
4．1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
5．1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
6．1%麦芽糖溶液：称取麦芽糖1g，溶于100mL蒸馏水中。
7．1%淀粉溶液：称取 可溶性淀粉1g与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾
入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水 稀释至100mL。
五、操作
先取1支试管加入斐林试剂约 1mL，再加入4 mL蒸 馏水，加热煮沸，如有沉淀生
成，说明此试剂已不能使用。经检验，试剂合格后，再进行下述实验。
取5支试管，分别加入菲林甲、乙液各1 mL，再向各试管分别加入1％葡萄糖溶液、
1％ 果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％麦芽糖溶液、1％淀粉溶液各1mL。置沸水浴中加热数分
钟，取出，冷 却。观察各管溶液的变化。
另取6支试管，用本尼迪克特试剂（每管加2mL）重复上述实验。
比较两种方法的结果。
斐林氏与本尼迪克特试法：

现象
试剂
斐林氏试剂
本尼迪克试剂
溶液
液


1%
葡萄糖溶
1%
果糖溶液


1%
蔗糖溶液


1%
麦芽糖溶
液


1%
淀粉溶液


5

试解释以上表格现象：
六、思考题
1．斐林氏、本尼迪克特试剂法检验糖的原理是什么？
2．你熟悉的糖中那些具有还原性？

实验三 蛋白质的颜色反应
一、实验目的
熟悉一些常见蛋白质的颜色反应
二、实验原理
蛋白质分子中的某些基团与显色剂作 用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨
基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质 的专一反应，一些非蛋白物质亦
可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是 蛋白质。颜色反
应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。重要的颜色反应有：
1.双缩脲反应
将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩
脲在碱性 溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中
含有许多和双缩脲结构相 似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可
用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反 应产生的颜色在540nm 处比色，定量测定蛋白
质。

2.蛋白质的黄色反应
6

黄色反应是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有 的呈色反
应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深
呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮
肤、指甲和毛 发等遇浓硝酸会变成黄色。

3.米伦氏反应
米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸 和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后
即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此 反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨
酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。


4.茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此 反应为
一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应
7

三、器材
试管和试管架、滴管、水浴锅、酒精灯或电炉、量筒、滤纸片、烘箱、白明胶。
四、试剂
1. 卵清蛋白液：将鸡(鸭)蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏
备用。
2. 0.5%苯酚溶液：苯酚0.5mL，加蒸馏水稀释至100mL。
3. 1%白明胶液：1g 白明胶溶于少量热水，完全溶解后，稀释至100mL。
4. 米伦(Millon)试剂：40g 汞溶于60mL 浓硝酸(比重1.42)，水浴加温助溶，溶解后加2倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。
5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。
6.浓硝酸：比重1.42。
7. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水中，稀释至100mL。
8. 尿素：如颗粒较粗，最好研磨成粉末状。
9. 10%氢氧化钠溶液：氢氧化难10g溶于蒸馏水，稀释至100mL。
五、操作方法
1.双缩脲反应
①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出 的氨可
用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶
液1mL 混匀，观察有无紫色出现。
②另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO
4
溶液4
滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。
注意事项：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐
与铜 盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH
3
)
4
2+
，妨碍此颜色反应 的观察。
2.蛋白质的黄色反应
8

在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶
液5滴，观察颜色反应。
3.米伦氏反应
① 用苯酚做实验：取0.5%苯酚溶液1mL 于试管中，加米伦试剂约0.5mL(米伦试剂
含有硝酸， 如加入量过多，能使蛋白质呈黄色，加入量不超过试液体积的15～14)，小心
加热，溶液即出现玫瑰 红色。
② 用蛋白质溶液做实验：取2mL 蛋白质溶液，加0.5mL 米伦试剂，此时出现蛋白质
的沉淀(因试剂含汞盐及硝酸之故)，小心加热，凝固之蛋白质出现红色。
注意事项：蛋白质溶液中如含有大量无机盐，可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用，
如此试剂不 能测定尿中的蛋白质。另外试液中还不能含有H
2
O
2
、醇或碱，因它们能使 试剂
中的汞变成氧化汞沉淀。遇碱必须先中和，但不能用盐酸中和。
4.茚三酮反应
取1mL 蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注
意：此 反应必须在pH5～7进行)。
六、思考题
1. 氨基酸与蛋白质具有哪些共同的颜色反应？说明原因。
2. 蛋白质除了可以实验中的这些颜色反应外，你还知道哪些蛋白质的颜色反应？
实验四 蛋白质的沉淀反应
一、实验目的
加深对蛋白质的沉淀反应的认识，理解蛋白质沉淀反应的原理。
二、实验原理
蛋白 质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性
基团，如—NH
3
+
，—COO-，—SH，—CONH
2
等，和水有高度亲和性，当蛋白质 与水相遇
时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而
不会沉淀。 蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状
态时带有相同电荷，使蛋白 质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液 中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素
破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液 就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：
1. 加盐类如硫酸铵、 硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和
了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生 沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析 时所需的盐浓度不同，因此调节盐
浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分 段盐析。但中性盐
并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶 解。
9

2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这 些有机溶剂和水有较
强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀 与丙
酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸 铅及三氯化铁等。这是因为蛋白质在碱性溶液中
带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解 的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉
淀。 < br>用盐析法或低温下加入丙酮、乙醇使蛋白质沉淀，以及利用等电点的沉淀反应时，虽
然蛋白质已经 沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的生物活
性。如除去沉淀因素，蛋白质 可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆
沉淀作用。但如在温度较高情况下加入有机溶 剂来沉淀分离蛋白质或已用有机溶剂沉淀分
离得到的蛋白质没有及时与有机溶剂分开，都会引起蛋白质的 性质发生改变，这应该注意。
三、器材
试管及试管架、吸管、抽滤瓶、量筒、布氏漏斗。
四、试剂
1. 蛋白质氯化钠溶液取20mL 蛋清，加蒸馏水200mL 和饱和氯化钠溶液100mL，充
分搅匀后纱布滤去不溶物(加氯化钠的目的是溶解球蛋白)。
2. 蛋白质溶液 取5mL 蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后，用纱布过滤。
3. 饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中，在70～80℃下搅拌促溶 ，
室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。
4. 饱和苦味酸溶液：取2g 苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水100mL，80℃水浴约10min
使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即为饱和苦味酸，此液可存放
数年。
5. 1%醋酸溶液、1%醋酸铅溶液、1%硫酸铜溶液、1%三氯乙酸溶液。
6. 0.5%磺基水杨酸溶液。
7. 5%鞣酸溶液。
8. 硫酸铵粉末。
五、操作
1.盐析作用：取1支试管加入3mL 蛋白质氯化钠溶液和3mL 饱和硫酸铵溶液，混匀，
静置约10min，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅
拌，直至粉 末不再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否
溶解。
2.乙醇 沉淀蛋白质：取1支试管架蛋白质溶液1mL，加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使
沉淀完全)待溶解后再 加入95%乙醇2mL 混匀。观察有无沉淀析出。
3.有机酸沉淀蛋白质：取2支试管，各加入蛋白 质溶液约0.5mL，然后分别滴加10%
三氯乙酸和0.5%磺基水杨酸数滴。观察蛋白质沉淀。 < br>4.重金属盐沉淀蛋白质取：2支试管各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，
另一 管内滴加1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。
5.生物碱试剂沉淀蛋白质取：2支试管，各加蛋白溶液2mL 及1%醋酸4～5滴。其中
10

一管滴加5%鞣酸，另一管滴加饱和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。
六、思考题
1.蛋白质的中性盐沉淀和重金属沉淀有何差别？各有什么用途？
2.为什么鸡蛋清可作为铅或汞中毒的解毒剂？
实验五 蛋白质等电点测定
一、实验目的
掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
了解等电点的意义及其与分子聚沉能力的关系。
二、实验原理
蛋白质同氨基酸一样，是两性电解质，在不同的pH 水溶液中解离后所带正、负电荷
不同。调 节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相
等，以兼性离子状态出现 ，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这
时溶液的pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。
各种蛋白质具有特定的等电点，这时和它所含的氨基酸的种类和数 量有关。如蛋白质
分子中含碱性氨基酸较多，其等电点偏碱。例如从雄性鱼类成熟精子中提取的鱼精蛋白 含
精氨酸特多，其等电点为12.0～12.4。如蛋白质分子中含酸性氨基酸较多，则其等电点偏酸。例如胃蛋白酶含酸性氨基酸残基为37个，而碱性氨基酸残基仅含6个，其等电点为
1.0左右 。含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点大多为中性偏酸，约5.0
左右。
蛋 白质等电点多接近于pH7.0，略偏酸性的等电点也较多。处于等电点的蛋白质表现
电中性，所以在溶 液中的稳定性很低，容易沉淀析出。将酪蛋白溶液分置于连续不同的pH
环境中，通过观察混浊程度可测得酪蛋白的等电点。
三、器材
试管和试管架、滴管、吸管(1和5mL)、容量瓶。
四、试剂
1. 酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25g，加蒸馏水20mL 及1.00molL 氢氧化钠
溶液5mL(必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00molL 醋酸5mL(必须准确)，倒入
50mL 容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果酪蛋白溶于0.10molL 醋酸钠溶液内，
其浓度为0.5%。
2. 0.01molL 醋酸溶液
3. 1.00molL 醋酸溶液
4. 0.10molL 醋酸溶液
5. 1.00molL 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸的浓度要标定）
五、操作
1.取9支粗细相近的干燥试管，编好号后按表5-1的顺序准确地加入各种试剂。
11

2.加完后观察上述各管的混浊程度，静置约20min，再视其沉淀情况，以-，+， ++，
+++，++++符号表示沉淀的多少。根据观察的结果，指出哪一个pH 是酪蛋白的等电点(混
浊显著或静置后沉淀最多，上部溶液变得最清亮一管的pH 值，即为酪蛋白的等电点)。
3. 该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心 配制试剂以外，
实验中应该严格按照定量分析的操作进行。为了保证实验的重复性或为了进行大批 量的 测
定，可以事先按照上述的比例配制成大量的9种不同浓度的醋酸溶液。实验时分别准确吸
取4 mL该溶液，再各加入1mL酪蛋白醋酸钠溶液。
表5-1 试剂加入及数据记录表
管
号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
酪蛋白醋
酸钠溶液
（毫升）
1
1
1
1
1
1
1
1
1
水
（毫升）
8.38
7.75
8.75
8.50
8.00
7.00
5.00
1.00
7.40
0.01molL
醋酸
0.10molL
醋酸
1.00molL
醋酸 pH
观察沉淀出现情况
0
分钟
5.9
5.6
5.3
5.0
4.7
4.4
4.1
3.8
3.5









10
分钟









20
分钟









（毫升） （毫升） （毫升）
0.62
1.25
￣
￣
￣
￣
￣
￣
￣
￣
￣
0.25
0.50
1.00
2.00
4.00
8.00
￣
￣
￣
￣
￣
￣
￣
￣
￣
1.60
六、思考题
1.该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
2.蛋白质等电点在实际生产上有何意义？

实验六 酪蛋白的制备——等电点沉淀法
一、实验目的
1、了解等电点沉淀法
2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法
3、加深对蛋白质等电点性质的理解
二、实验原理
蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋 白质
又是一种两性离子，在一定pH溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的pH
值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被
破坏，蛋白质分 子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时
12

溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35gL。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，
等电点为4.7 。将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类
杂质后便可得到较纯的酪 蛋白。
但单独利用等电点沉淀法来分离生化产品效果并不太理想，因为即使在等电点时，有
些 两性物质仍有一定的溶解度，并不是所有的蛋白质在等电点时都能沉淀下来，特别是同
一类两性物质的等 电点十分接近时。生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法并用，这样沉淀
的效果较好。
三、器材
离心机、抽滤装置（布氏漏斗）、电炉、温度计、天平、表面皿、烧杯、容量瓶、移液
管、酸度 计。
四、试剂
（1）鲜牛奶；（2）0.5molL HCl；（3）0.5 molL NaOH；（4）95％乙醇；（5）无水之
醚；（6）0.2molLpH4.7醋酸－醋酸钠缓冲液 ，先配制A液与B液。（A液：0.2 molL醋酸
钠溶液：称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2 000 mL。B液：0.2 molL醋酸溶液。称取优级
纯醋酸（含量大于99.8％）12g定容至1 000 mL。取A液1 770 mL，B液1 230mL混合即
得pH4.7的醋酸钠－醋酸缓冲液3 000 mL。）；（7）乙醇－乙醚混合液。乙醇：乙醚＝1：1
（V／V）。
五、操作
1.将50mL牛奶加热到40℃。在搅拌下慢慢加入预热到40℃的pH4.7的醋酸缓冲液
50mL 。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷至室温。离心15 min(2000
rmin)，弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2.用水洗沉淀，离心10 min(3000 rmin)，弃去上清液；如此操作三次。
3.在沉淀中加入30mL乙醇。搅拌片刻，将全部悬浊液 转移至布氏漏斗中抽滤。用乙
醇－乙醚混合液洗沉淀两次。最后用乙醚洗沉淀两次，抽干。
4.将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。
5.准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g100mL牛乳。

式中理论含量为3.5g100mL牛乳。
六、思考题
1.为什么调整溶液的pH值可将酪蛋白沉淀出来？
2.你还可以采用哪些其他的方法来制备酪蛋白？
3.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？


13

实验七 氨基酸的纸层析
一、实验目的
1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。
2.学习纸层析法的操作技术，分析未知样品氨基酸的成分。
二、实验原理
用滤纸 为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所
用的展层溶剂大多是由水饱 和的有机溶剂组成。滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团，可吸
附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂 作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行
层析；反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。 将样品点在滤纸上进行展层，样
品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不 同，故在流动相
中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。纸层析法主要是依据混合组分对
二相分配系数的差异进行分离，但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。氨基酸
经层析 在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用R
f
表示。
R
f
= 原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离

只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变，R
f
值是常 数，因
此可做定性分析参考。R
f
值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸 的质量和层
析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。
三、器材
1．层析缸
2．毛细管
3．喷雾器
4．培养皿
14

5．层析滤纸（新华一号）
6．小烧杯（50mL）
7．铅笔
8．直尺
四、试剂
1.展层剂：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(VV)，摇匀后放置半天以上，取上清液
备用。
2.氨基酸溶液（用0.01 molL的盐酸配制）：0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨
酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（ 各组份浓度均为0.5％）。
3.显色剂：0.1%水合茚三铜正丁醇容液。
五、操作
1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2．取层析滤纸（长22cm、宽15c m）一张。在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一
条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如下图 。

3．点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸< br>上扩散的直径最大不超过3mm。
4．扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿
迅速置于密闭的层析缸中 ，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需
低于点样线1cm）。待溶剂上升 15～20 cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自
然干燥或用吹风机热风吹干。
15

5．显色 用喷雾器均匀喷上0.1％茚三酮正丁醇溶液，然后置80 ℃烘箱中烘烤3～5分
钟或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6．计算各种氨基酸的R
f
值。
六、思考题
1．何谓纸层析法？
2．何谓R
f
值？影响R
f
值的主要因素是什么？
3．怎样制备展层剂？
4．层析缸中平衡溶剂的作用是什么？

实验八 电泳技术——纸电泳分离氨基酸
一、实验目的
1.了解电泳技术的基本原理；
2.掌握纸上电泳的原理和操作技术。
二、实验原理
带电颗粒在电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动，称为电泳（electrophoresis）。
电泳现象早在1808年 就被发现，但是作为一项生物化学研究的方法学，却是在1937年
Tiselius在电泳仪器方面取 得重大成就后，才得到较大的进展。特别是后来应用滤纸作为支
持物，形成了设备简单，操作方便的纸上 电泳法后，电泳技术在生物化学和其他领域研究
中得到了广泛的应用和发展。近年来，由于采用多种新型 支持物，仪器装置亦得到不断改
进，因此出现了许多新型的电泳技术。
目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳，自由界面电泳和区带电泳。区
16

带电泳应用比较广泛，按其支持物物理性状的不同可分成4大类：
1.滤纸及其他纤维（如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电泳。
2.凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。
3.粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃分电泳。
4.线丝电泳：如尼龙丝，人造丝电泳。此为微量电泳方法。
区带电泳现已广泛应用于生物化 学物质的分析分离以及临床检验等方面。现以纸上电
泳为例介绍有关电泳的原理和操作技术。
任一物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其他带电质点，在电场中
便会向一定的电极移 动。例如氨基酸、蛋白质分子等，由于它具有许多可解离的酸性基团
和碱性基团，如-COO和-NH< br>3
+
等，它是一典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会
解离而带电，带 电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及溶液的pH值和离子强度。在
某一pH条件下，蛋白质分子所 带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零。此时
蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这—pH值 ，称为该蛋白质的等电点(pI)。如果溶液的
pH小于pI，则蛋白质分子结合一部分H，而带正电荷 ，在电场中就会向负极移动。反之，
溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出—部分H而带有负电， 此时蛋白质分子在电场
中就会向正极移动。
不同的带电颗粒在同—电场中泳动速度不同，常用 迁移率(或称泳动度，mobility)来表
示。迁移率的定义是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速 度。
－
mvE
dt
dltV

Vl
式中： m为迁移率(cm
2
V·s)；v为颗粒的泳动速度(cms)；E为电场强度(Vcm)；d 为
颗粒泳动的距离(cm)；l为滤纸的有效长度(cm)，即滤纸与两极溶液交界面间的距离；V为< br>实际电压(V)；t为通电时间秒(s)。
通过测量d，l，v，t便可计算出颗粒的迁移率。
带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量，颗粒的大小和形状有关。一般
说，所带净 电荷量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中的泳动速度愈快，反之则愈
慢。泳动速度除受颗粒本身 性质的影响外，还和其他外界因素有关。
现将影响颗粒泳动速度的外界因素讨论如下：
1、 电场强度：电场强度是指每lcm的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度对
泳动速度起着决定 性作用。电场强度愈高，则带电颗粒泳动愈快。例如进行纸上电泳时，
滤纸两端相距20cm处测得电位 降为200V，则电场强度为20020＝10Vcm。
纸上电泳根据电场强度的大小可分为常压(100～500V)纸上电泳和高压(2 000～10 < br>000V)纸上电泳，前者电场强度一般为2～10Vcm，分离时间较长，从数小时到数天。后
者电场强度为50～200Vcm，电泳时间很短；有时仅需数分钟。常压纸上电泳多用于分离
蛋白质等 大分子物质，高压纸上电泳则多用来分离氨基酸，多肽、核苷酸、糖类等小分子
物质。
2、溶 液的pH值；溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的
多少。对蛋白质两性电解 质而言，pH值离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度
也越快，反之，则越慢。因此当分离某 一蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH，使各种
17

蛋白质所带的电荷 量差异较大，有利于彼此分开。为了使电泳过程中溶液pH值恒定，必
须采用缓冲溶液。
3、 溶液的离子强度：离子强度影响颗粒的电动电势(ξ)，溶液的离子强度越高，电动
电势越小，则泳动速 度越慢；反之，则越快。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。溶液
离子强度的计算方法如下：
I

CZ
2
2

式中：I为溶液的离子强度；C为离子的摩尔浓度；Z为离子的价数。
4、电渗：在电场中， 由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场
作用下，溶液就向一定方向移动，称为电 渗现象。在纸上电泳中，由于纸上吸附OH
-
离子
带负电荷，而与纸相接触的水溶液带 正电荷，液体便向负极移动，移动时可携带颗粒同时
移动。所以电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的 泳动速度与由于电渗影响而被携带的
移动速度两者的加和。若是颗粒原来向负极移动，则其表观速度将比 泳动速度快，若原来
向正极移动，则其表观速度将比泳动速度慢。
为了校正这一误差，可用一 中性物质如糊精，蔗糖或葡聚糖等与样品平行作纸上电泳，
然后将其移动距离自实验结果中除去。 5、滤纸的选择：要求纸质均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，使结果不能重复，
并得不到好的 图谱。如果吸附力大，则蛋白质或其他胶体在它们泳动的过程中有一部分被
纸所吸附，以致于泳动快的部 分其相对含量降低。因此常将滤纸事先处理，以减低滤纸的
吸附能力，使达到更好的分离效果。若选用国 产新华滤纸，或WhatmanNo.1号滤纸，一般
不必再进行预处理。
6、其他因素：例 如缓冲溶液的粘度。缓冲溶液与带电颗粒的相互作用以及电泳时温度
的变化等因素，也都影响泳动速度。
本实验以混合氨基酸为材料，用纸上电泳法分离其中的不同氨基酸。
三、器材
水平 式电泳槽、电泳仪、吹风机、点样器、喷雾器、铅笔、杭州新华滤纸或WhatmanNo.1
号滤纸
四、试剂
1、115molL磷酸盐缓冲液(离子强度0.08，pH6.0)
配制方法：
甲液：115molL Na
2
HPO
4
溶液（Na
2
HPO
4
9.465g；蒸馏水加至1000mL）
乙液：l15molL KH
2
PO
4
溶液 （KH
2
PO
4
9.07g；蒸馏水加至1000mL）
分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按 1︰9比例混合，即可得所
需pH的缓冲液。
2、1%丙氨酸、1%谷氨酸、1%赖氨酸标准溶液。
吸取上述氨基酸标准溶液各10mL于50mL烧杯中配成混合样品。
3、显色液（0.5%茚三酮丙酮溶液）
五、操作
1、仪器及样品的准备
18

将电泳槽洗净，晾干、放平。然后量取约700～800mL缓冲液先 倒入电泳槽，使两端
液面达到平衡。
2、滤纸的剪裁
用刀片将新华滤纸或Wh atmanNo.1号滤纸，裁成长21.5cm，宽13.8cm的滤纸条，并
按以下规格用铅笔作上 正负记号。
剪裁前要选择纸质比较均匀的纸，用刀片裁整齐，注意纸边不能有缺刻或起毛，可先
用废纸条练习，然后再正式裁剪。
3、点样
1）原点的位置和形状：对于一个未知样品， 初次实验时，应将样品点在滤纸条的中央，
观察区带的两极泳动情况，即可选择出点样位置。
样品可点成长条形，或圆点状。一般长条形分离效果较好，但样品很少时，点成圆点，
样品比较集中，便 于显色。但双向电泳或一向电泳、一向层析结合使用时则必须点成圆点
或椭圆点，不能点成长条。 2）点样量：随滤纸的厚度，原点的宽度，样品的溶解度，显色方法的灵敏度，样品迁
移率的差异而 有所不同。样品量过多时拖尾和扩散比较严重，不能获得最有效的分离。样
品量太少时，将无法检出。
3）点样方法：可分干点法和湿点法两种。
湿点法：先将滤纸用喷雾器均匀地喷上缓冲液，或 将滤纸浸于缓冲液中，浸透后取出，
夹在两普通滤纸中，轻压，将多余缓冲液吸去。缓冲液与干纸重量比 为1.2︰1～2.5︰1。
然后架起滤纸，在纸上用点样管将样品画成长条形。注意画线要直，且粗细 均匀，千万不
可将滤纸画毛，损伤纸面。以湿点法点样品时，点的次数不宜多，因此如果样品浓度较低< br>时，必须事先浓缩。
干点法：将样品点于纸上，待第一次样品晾干，再点第二次。画线必须细直 ，粗细均
匀，直到将所需要的样品全部点完为止。可用吹风机冷风加速干燥，而后小心地用喷雾器
将滤纸两端喷湿，有样品处空出，让其缓冲液经扩散而自行湿润。或将滤纸除样品部分外
浸于缓冲液中 ，放置片刻，样品部分靠毛细管作用而湿润，多余缓冲液用普通滤纸吸去。
干点法和湿点法各有利弊， 干点法虽然在点样过程中起浓缩的作用，但点的次数多时，
纸面容易受损，样品干坏。湿点法虽不宜用作 稀的样品，却可保持样品的天然状态。
点样前，可用废滤纸条先以水代替样品进行练习，当操作熟练后再正式点样。
本次实验采用干 法点样，在滤纸的中间位置横着划一直线，在直线上每隔2~3cm作一
记号“×”，用毛细管分别吸取 标准丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸各3uL及混合液10uL，小心点
于滤纸上，点样直径不能大于0.5c m，每点一次用电风筒吹干，再点第二次，再吹干，直
到点完。
4、电泳
将滤纸 架放入电泳槽中，标有正号的一端应放在正极槽内，负号的一端放在负极槽内。
并把滤纸条拉紧，使其成 为平面，避免中间下垂。
盖上玻璃盖，关闭电泳槽中间活塞，检查好线路。然后打开电源开关，调整电 压到250V
左右，并观察或测量其电流数值，记下通电时间。
为了计算迁移率，要用万用电表测量滤纸的有效长度两端的实际电压，记下读数。
19

5、烘干
通电0.5小时后，关闭电源开关，在滤纸与溶液交界处作上记号 (以便测量长度l)，然
后将滤纸条由滤纸架上取下，分别平插在具有两排细针的木架上放入105℃烘 箱中烘干15
分钟。或吹干。
6、染色
浸显色剂。
7、吹干至出现斑点。
8、绘出结果图，指出各斑点的氨基酸酸碱性质并说明你判断的依据。
六、思考题
1.A pI=9，B pI=11。设计一个最佳电泳分离方案。
2.电泳技术可否用于定量分析？






实验九 酶的催化特性
一、实验目的
通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响
二、实验原理
酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度特异（专一）性，即一种酶只能 对一
种底物或一类底物（此类底物在结构上通常具有相同的化学键）起催化作用，对其他底物
无 催化反应。例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都是催化糖苷键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起
作用，蔗糖酶只水 解蔗糖。还原糖产物可用班尼迪克特试剂鉴定。
通过比较淀粉酶在不同pH、不同温度以及有无抑制剂 或激活剂时水解淀粉的差异，说
明这些环境因素与酶活性的关系。
三、器材
恒温水 浴（37℃，70℃）、沸水浴（100℃）、冰浴（0℃），试管18×180共19支，
20 < /p>

吸管1mL7支、2mL3支、5mL5支，量筒100mL1个，白瓷板，胶头滴管3支
四、试剂
2%蔗糖溶液：用分析纯蔗糖新鲜配制。
1%淀粉溶液：1g淀粉和0.3g NaCl，用5mL蒸馏水悬浮，慢慢倒入60mL煮沸的蒸馏< br>水中，煮沸1min，冷却至室温，加水到100mL，冰箱贮存。
0.1%淀粉溶液：0.1 g淀粉，以5mL水悬浮，慢慢倒入60mL煮沸的蒸馏水中，煮沸
1min，冷却至室温，加水到10 0mL，冰箱贮存。
班尼迪克特（Benedict）试剂：17.3g 无水硫酸铜，加100mL 蒸馏水加热溶解，冷却；
173g柠檬酸钠和100g无水碳酸钠，以600mL蒸馏水加热溶解，边加 边搅匀，最后定容至
1000mL。如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。
碘液：2g碘 化钾溶于5mL蒸馏水中，加1g碘，溶解后再加295mL水，混匀贮存于
棕色瓶中。
磷酸缓冲液：
A液：0.2molL Na
2
HPO
4

称取28.40g Na
2
HPO
4
(或71.64g Na
2
HPO
4
•12H
2
O)溶于1000mL水中。
B液：0.1molL 柠檬酸
称取21.01g柠檬酸（C
6
H
8
O
7
•H
2
O）溶于1000mL水中。
pH5.0缓冲液：10.30mL A液+9.70mL B液
pH7.0缓冲液：16.47mL A液+3.53mL B液
pH8.0缓冲液：19.45mL A液+0.55mL B液
1% CuSO
4
•5H
2
O溶液。
1% NaCl。
唾液淀 粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含10mL左右蒸馏水，轻轻漱动，2分钟后吐
出收集在烧杯中，即得清 澈的唾液淀粉酶原液，根据酶活高低稀释50倍，即为唾液淀粉酶
溶液。
蔗糖酶溶液：取1g 鲜酵母或干酵母放入研钵中，加入少量石英砂和水研磨，加50mL
蒸馏水，静置片刻，过滤即得。
五、操作
1、酶催化的专一性
取6支干净试管，按下表操作：
操作项目
1%淀粉(mL)
2%蔗糖(mL)
唾液淀粉酶原液(mL)
蔗糖酶溶液(mL)
蒸馏水(mL)
酶促水解
管号
1
1
0
1
0
0
2
1
0
0
1
0
3
0
1
1
0
0
4
0
1
0
1
0
5
1
0
0
0
1
6
0
1
0
0
1
摇匀，37℃水浴中保温10min
21

班尼迪克特试剂(mL)
反应
现象
2、pH对酶活力的影响
2 2 2 2 2 2
摇匀，沸水浴中加热5～10min

取3支试管，按下表操作：
操作项目
pH5.0磷酸缓冲液(mL)
pH7.0磷酸缓冲液(mL)
pH8.0磷酸缓冲液(mL)
1%淀粉溶液(mL)
预保温
唾液淀粉酶溶液(mL)
管号
1
3
0
0
1
2
0
3
0
1
3
0
0
3
1
混匀，37水浴中保温2min
1 1 1
摇匀，置37℃水浴中继续反应2分钟，每隔1
检查淀粉水解程度
分钟从第2号管中取出1滴 反应液于白瓷板上，加碘液
检查反应进行情况，直至反应液不再变色，即可停止反
应，取出所有 试管。
碘液(滴)
现象






3、温度对酶活力的影响
取3支试管，按下表操作：
操作项目
唾液淀粉酶溶液(mL)
pH7.0磷酸缓冲液(mL)
温度预处理5min（℃）
1%淀粉溶液(mL)
管号
1
1
2
0
2
2
1
2
37
2
3
1
2
70
2
1

1 1
摇匀，保持各自温度继续反应，5分钟后每隔1分钟从第2号管吸取1滴反应液于白
瓷板上，用 碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只有碘液的颜色），立即取出
所有试管，流水冷却2mi n，各加1滴碘液，混匀。观察并记录各管反应现象，解释之。
4、酶的抑制与激活
22

操作项目
1% NaCl(mL)
1% CuSO
4
(mL)
蒸馏水(mL)
唾液淀粉酶溶液(mL)
0.1%淀粉溶液(mL)
保温反应并检查淀粉水
解程度
碘液(滴)
现象
注意事项
管号
1
1
0
0
1
3
2
0
1
0
1
3
3
0
0
1
1
3
摇匀，37℃ 水浴反应1min左右即可用碘液检查1
号试管淀粉水解程度，待1号试管的反应液不再变色时
取出所有试管。
1

1

1

（1 ）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验2、3、4应随时检查反应进行情况。如反
应进行得太快，应适 当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。
（2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为 唾液中含有少量Cl。另外，注意不
要在检查反应程度时使各管溶液混杂。
六、思考题：
1.何谓酶的最适pH和最适温度？
2.说明底物浓度、酶浓度、温度和pH对酶反应速度的影响。
3.

酶作为一种生物催化剂，有哪些催化特点？
－

实验十 糖化酶活力测定
一、实验目的

1、 学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。
2、 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。
二、实验原理
糖化型淀 粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀
粉酶作用于淀粉，然后用碘量 法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。
碘量法定糖原理：
淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所
氧化：
23

体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶
的活力。
I
2
＋2Na
2
S
2
O
3
= Na
2
S
4
O
6
＋ 2NaI
三、器材
仪器
吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、 碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、
分析天平。
原料：
待测酶液
四、试剂
1. 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2
小时)，加少量蒸馏水调匀。倾入80mL左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水
定容至1 00mL。
2. 0.05 molL碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至
1000mL。
3. pH4.5的1molL醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容< br>至1000mL。取分析纯冰醋酸5.78mL定容至1000mL。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体< br>积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。
4. 0.1 molL氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000mL。
5. 1molL硫酸 ：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5mL，缓缓如入944.5mL水定容至
1000mL。
6. 0.1molL硫代硫酸钠：称取25克硫代硫酸钠(Na
2
S
2O
3
·5H
2
O)和0.4克碳酸钠，用煮
沸冷却的蒸馏水溶解 并定容至1000mL，配制后放置三天再标定。
五、操作
取2％可溶性淀粉溶液25mL 加pH4.5醋酸缓冲液5mL混匀，在40℃恒温水浴中预热
5－10分钟加入待测酶液2mL准确计 时1小时。取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷
却至室温。取上述反应液5mL于定容瓶中，先 加入0.05molL碘液10mL，再加0.1 molL
NaOH 10mL，摇匀暗处静置15 分钟。加入1molL硫酸2mL。用0.1molL的硫代硫酸钠
滴定至无色，记录滴定值B mL。 并以蒸馏水代替酶液，同法保温后测定，记录消耗硫代
硫酸钠的体积AmL。其与空白消耗硫代硫酸钠毫 升数的差值应在4~6之间，否则要适当调
整酶液的稀释倍数。
24

六、计算
M90.05

酶活力单位（毫克毫升）= （A-B）
A—空白所消耗的Na
2
S
2
O
3
的毫 升数；
B—样品所消耗的Na
2
S
2
O
3
的毫升数；
90.05—1mL1molL的Na
2
S
2
O
3
相当的葡 萄糖毫克数；
V
1
—酶液的体积(2mL)；
V
2
—反应液总体积(32.20mL)；
V
3
—吸取反应液样品体积(5mL)；
n—酶液稀释倍数；
M—Na
2
S
2
O
3
的摩尔浓度(0.1molL)。
七、思考题
1.在本实验中酶的活力单位是怎样定义的？
2.在活力测定的过程中要注意哪些问题？
1
V
2
n

V
1
V
3






实验十一 从酵母提取核糖核酸——稀碱法
一、实验目的
了解并掌握稀释碱法提取RNA
二、实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而 提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂
法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀 浆用苯酚处理并离心后，RNA即
溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加 入乙醇后，RNA即
以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具 有生物
活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，< br> 25

主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯 化钠溶液，90℃提
取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀 碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去
蛋白质和菌体后 的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%， 而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵
母为原料。
三、器材
乳钵；烧杯；三角瓶；移液管（2.0ml, 5.0ml）；量筒（10, 50ml）；沸水浴；离心机；
布氏漏斗；抽滤瓶；石蕊试纸；滴管等；干酵母粉。
四、试剂
0.04MNaOH溶液；95%乙醇；乙醚； 乙酸；
酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL的浓硫酸。
五、操作
称5g干酵母粉悬 浮于0.04molL的NaOH溶液40mL中，并在乳钵中研磨均匀。将悬
浮液转移至150mL三 角瓶中，在沸水浴上加热30min，经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液
使提取液呈酸性（石蕊试纸检查 ），3000rmin离心15min。取上清液，加入10mL酸性乙
醇，边加边搅动（最终清液pH 值为2.5）。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，离心。滤渣
先用95%乙醇洗两次，每次用10mL 。再用乙醚洗两次，每次10mL，洗涤时间可用细玻璃
棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在 空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，
计算：
干酵母粉RNA含量(%)＝
六、思考题
RNA重（g）
100%
干酵母粉重（g）

1．为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？
2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?
3．如何得到高产量RNA的粗制品？

实验十二 从酵母提取核糖核酸——浓盐法
一、实验目的
学习和掌握从酵母中提制RNA 的原理和方法，从而加深对核酸性质的认识。
二、实验原理
提取和制备RNA 的首要问题是选RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核
酸的原料，其中RNA 的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA（2.67～10.0%），
DNA 很少（0.03～0.516％），而且菌体容易收集，RNA 也易于分离。此外，抽提后的菌
26

体蛋白质（占干菌体的50%）仍具有很高的应用价值。
RNA 提制过程首先要使RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。
再根据核酸在等电点 时溶解度最小的性质，将pH 调至2.0～2.5，使RNA 沉淀，进行离
心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤RNA 沉淀。提取RNA 的
方法很多，在工业生产上常用的 是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解，
使RNA 释放出来，这种方法提取时间短，但RNA 在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解；
浓盐法是在加热的条 件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA 释放出来，此法
易掌握，产品颜色较好。使用浓盐法提出RNA 时应注意掌握温度，避免在20～70 ℃之间
停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围，会使RNA 因降解而
降低提取率。在90～100℃条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，
有利于R NA 的提取。
三、器材
1．实验材料
活性干酵母；pH0.5～5.0 的精密试纸；冰块。
2．仪器
（1）药物天平
（2）三角瓶（100mL）
（3）量筒（50mL）
（4）水浴锅
（5）电炉
（6）试管木夹
（7）离心管
（8）离心机（4 000rmin）
（9）烧杯（250mL, 50mL, 10mL）
（10）滴管及玻棒
（11）吸滤瓶（500mL）
（12）布氏漏斗（60mm）
（13）表面皿（8cm）
（14）烘箱
（15）干燥器
（16）紫外可见分光光度计
四、试剂
（1）NaCl（化学纯）
（2）6molL HCl
（3）95%乙醇（化学纯）
五、操作
1．提取
活性干酵母粉5g，倒入100mL 三角瓶中，加NaCl 5g，水50mL，搅拌均匀，置于沸
水浴中提取1h。
27

2．分离
将上述提取液取出，立即用自来水冷却，装入大离心管内，以3 500rmin 离心10min，
使提取液与菌体残渣等分离。
3．沉淀RNA
将离心得到的上清液倾于50mL 烧杯中，并置于放有冰块的250mL 烧杯中冷却，待
冷至10℃以下时，用6molL HCl 小心地调节pH 至2.0～2.5。随着pH 下降，溶液中白
色沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制 pH）。调好后继续于冰水中静置
10min，使沉淀充分，颗粒变大。
4．抽滤和洗涤
上述悬浮液以3 000rmin 离心10min，得到RNA 沉淀。将沉淀物放在10mL 小烧杯
内，用95％的乙醇5～10mL 充分搅拌洗涤，然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用真空
泵抽气过滤，再用95％乙醇5～10mL 淋洗3 次。由于RNA 不溶于乙醇，洗涤不仅可脱
水，使沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去 可溶性的脂类及色素等杂质，提高了制
品的纯度。
5．干燥
从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸，放在8cm 表面皿上，置于80℃烘箱内干燥。将
干燥后的RNA 制品称重。
6．含量测定
称取一定量干燥后的RNA 产品配制成浓度为10～50μgmL 的溶液，在紫外可见分光
光度计上测定其260nm 处的光密度值，按下式计算RNA 含量：

RNA含量(%)=
OD
260nm
RNA溶液总体积（mL）< br>100

0.024LRNA称取量（

g）
式中：OD
260nm
为260nm 处的光密度值；L为比色杯的光径（cm）；0.024 为1mL溶
液含有1μg RNA 的光密度值。
五、结果计算
根据含量测定的结果按下式计算提取率：
RNA提取率(%)=
六、思考题
RNA含量(%)RNA制品量(g)
100

酵母重(g)
1．RNA 提制中注意事项是什么？
的基本类型有哪些？各自功能如何？
的提取还有何种方法？试比较各自的优缺点？
参考文献：
1. 石庆华.生物化学实验指导.北京：中国农业大学出版社，2006.
2. 淩浩.生物化学实验讲义.广东轻工职业技术学院自编教材，2002.
3. 王小华.生物化学与分子生物学施压技术.北京：化学工业出版社，2008.
28

实验十三 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较
一 实验目的
1、了解小麦（粮食种子）在发芽过程中生理特性的变化及其意义
2、掌握淀粉酶活力的测定方法
3、学习分光光度计的使用
二 实验原理 淀粉酶水解淀粉得到的麦芽糖还原3，5-二硝基水杨酸呈棕色，用分光光度计测定吸
光度，吸光度 值与麦芽糖浓度成正比，水解糖中麦芽糖浓度与淀粉酶活性成正相关。
三 操作步骤
1、 种子发芽：实验前3-4天，取小麦种子浸泡2.5hr，然后放入25℃恒温箱或室温
发芽
2、酶液提取：麦芽15颗+砂200mg+1%氯化钠溶液 用力磨碎 室温放置
20min（其间搅拌几次） 液体倒入离心管 1500rmin,离心7min 量筒测定
上清液体积。
取未发芽种子15粒做对照，方法同上。
3、酶活力测定：取25毫升刻度试管4支，按下表加入试剂（各试剂需在25℃）。
试管号 1
试剂
酶液
标准麦芽糖溶液
1%淀粉溶液
水

(1) 将各管混匀，放在25℃水浴中保温3min以后，立即向各管中加入10%的3， 5-
二硝基水杨酸溶液2ml。
(2)取出各试管，放入沸水浴中加热5min，冷至室温，加水稀释至25毫升，充分混
匀。
(3)用蒸馏水做参比，空白管做对照，在λ=500nm处测定各管的吸光度值，填入下
表， 平行测定2次，算平均值 。
吸光度
第一次

2
发芽种子的
酶提取液
0.5
—
1
—
3
标准管
—
0.5
1
—
4
空白管
—
—
1
0.5
未发芽种子的
酶提取液
0.5
—
1
—
未发芽种子的酶
提取液A
酶干


发芽种子的酶
提取液A
酶芽


标准管（A
标
）

空白管
（A
空白
）

29

第二次
平均值
4、计算








（1）根据吸光度值计算麦芽糖浓度：（A
标
- A
空白
）（A
未知
- A
空白
）=C
标
C
未知

（2）活力单位计算： 15粒种子的总活力单位=C
未
×n
酶
×V
酶

C
未
—酶液中麦芽糖的浓度，n
酶
—酶液的稀释倍数；V
酶
—提取酶液的总体积
（说明：本实验规定：25℃下，3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶 量为1个
酶活力单位）
实验十四 醋酸纤维薄膜电泳


一、

实验目的
1.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本原理
2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术
3.了解醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的应用
二、

实验原理
电泳是指带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象。带电粒子在电场中的
泳动速度除与电场强度、溶液的性质等有关外，主要决定于分子颗粒所带的电荷数量及其
分子的 大小与形状等。带电荷量越多、分子量越小、形状越规则的蛋白质泳动较快，反之
较慢。血清蛋白质约有 两百多种，其等电点一般在pH 4.0-7.3之间，故在pH8.6的缓冲液
中均带负电荷，在电场 中向正极移动。由于各蛋白质成份的pI不同，所带电荷数量不等，
加之分子大小和形状的差别，导致其 在同一电场中泳动的速度不同，从而可加以分离（见
下表）。





表1 人血清蛋白质等电点及分子量

相对含
量
57～72%
2～5%
4～9%
6～12%
分子量 pI
4.88
5.06
5.06
5.12
6.58～
7.50
m（cm
2
v·sec）
A
α
1

α
2

β
γ
69000
200000
300000
9000～150000
5.9×10
-5

5.1×10
-5

4.1×10
-5

2.8×10
-5

1.0×10
-5
12～20% 156000～300000
本实验是 以醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种电泳方法。醋酸纤维素薄膜具有均一的
泡沫状结构（厚约120μm ），渗透性强、对分子移动无阻力、分离清晰、无吸附作用、应
30

用范围 广和快速简便等优点，目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、
结构蛋白及同功酶的分 离测定等。
醋酸纤维素薄膜电泳可把血清蛋白分离为清蛋白（A）、a
1
-球蛋白、 a
2
-球蛋白、β-球
蛋白、γ-球蛋白5条区带。将薄膜置于染色液中使蛋白质固定 并染色后，可以看到清晰的
色带，而且由于各区带的颜色深浅与蛋白质含量几乎成正比，可将色带分别溶 于碱溶液再
进行比色测定，从而计算出血清蛋白的相对百分含量。
三、

实验仪器
电泳仪（稳压器、电泳槽）、分光光度计、醋酸纤维素薄膜（2cm
×8cm）、点样器（用
X光胶片制成）、表面皿、培养皿（供染色和洗脱用）、滤纸、镊子、5ml 刻度吸量管、
脱色摇床
四、实验试剂
1.新鲜血清：取全血5ml，离心取上清液。
2.巴比妥缓冲液（pH8.6）：巴比妥钠 15.458g，巴比妥2.768g，溶于1000ml蒸馏水中。
3.氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g，加冰醋酸l0ml及甲醇50ml，混匀，用蒸馏水稀释
至l00ml。
4.漂洗 液（3%冰醋酸溶液）：95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，混匀，用蒸馏水稀释至l00ml。
5.0.4molL NaOH：称取NaOH16g溶解蒸馏水中，定溶至1000ml，配制时结晶 会发热，应
边加水边混匀。
五、实验操作
1．薄膜准备
醋酸纤维素薄 膜呈白色，不透明，光面较毛面有光泽，干时脆，湿时有弹性。使用前，
先将薄膜置于巴比妥缓冲液内， 完全浸透至薄膜无白色斑点（约30min）备用。
2．仪器准备
制作“滤纸桥”： 剪裁尺寸合适的滤纸，取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端
与支架的前沿对齐，而另一端浸入缓冲 液内。待缓冲液将滤纸全部润湿后驱除气泡，使滤
纸紧贴在支架上，即“滤纸桥”。它们的作用是联系醋 酸纤维素薄膜和两极缓冲液之间的
“桥梁”。
3．点样
用镊子取出浸泡好的薄 膜，夹在两片滤纸之间用手轻压，吸去薄膜表面多余的缓冲液。
分清薄膜的光面和毛面，将毛面朝上，先 用铅笔在薄膜的一端做好记号，然后在距离薄膜
边缘约1.5cm处进行点样。点样时应注意点样器蘸取 的样品量适当，不可过多，位置居中。
点样采用“印章法”，双手将点样器垂直点在薄膜相应位置上，并 停留2-3s，让样品完全
渗入膜内。
4．膜条放置及平衡
点样完成后，将膜条转 移至电泳槽的滤纸桥上。放置膜条时应注意，手不可触碰膜条，
要将膜条的点样面朝下置于电泳槽的支架 上，点样端放在负极端，并且点样处不可搭在滤
纸桥上。放置好后还需要将膜条拉平整，排掉膜条与滤纸 接触部位的气泡。然后平衡约
5-10min，至缓冲液将薄膜全部湿润。
5．电泳
31

检查电泳槽正负极连接是否准确，然后打开电源开关，调节电压至10 0-160V，电流为
0.4-0.6mAcm宽。夏季电泳时间约45min，冬季电泳时间约60m in，待样品区带展开至薄
膜三分之二处时，停止电泳。
6．染色
用镊子小心取 出薄膜，浸于氨基黑10B染色液中染色1-3min（注：薄膜需完全浸入
染色液中且不重叠，染色时 间以清蛋白染透为止）。
7．漂洗
准备3个培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜 放入培养皿中，在脱色摇床上漂
洗数次，10min次，直至背景无色为止。将漂洗干净的薄膜用滤纸吸 干，此时可见界限清
晰的五条区带，从正极端起依次为：清蛋白（A）、a
1
-球蛋白 、a
2
-球蛋白、β-球蛋白及γ-
球蛋白（见下图）。




+ _
图1 正常人血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳示意图谱

8．定量分析
取6支大试管并编号，分别用吸量管量取0.4molL NaOH 4ml放入试管内。剪下薄膜上的各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的膜条作为空白对照，然后将六条带分别
浸泡于试管 内，不时摇动，使膜条上的颜色完全洗脱。30min后将洗脱液置于620nm波长
处比色，分别读取 各管的吸光度值并进行记录。


空白
膜
A α
1

α
1

带
4

α
2

α
2

带
4

β γ
空白膜 A带
4

β带 γ带
4

0.4molL NaOH
（ml）
A
620

9．结果计算
4 4
根据所测定的吸光度值，分别计算五种蛋白质的相对百分含量及AG比值，公式如下：
（1）各蛋白质的相对百分含量 = （x／T）×100％
其中x为该蛋白质的吸光度值；T为五种蛋白质的吸光度值之和
（2）AG比值（A为清蛋白的吸光度值；G为其余四种球蛋白的吸光度值之和）
正常参考值：
清蛋白：57.45-71.73% a
1
-球蛋白：1.76-4.48% a
2
-球蛋白：4.04-8.28%
32

β-球蛋白：6.79-11.39% γ-球蛋白：11.85-22.97% AG：1.24-2.36
六、学生操作注意事项
1. 点样线要细窄、均匀、集中，量不宜过多，保持薄膜清洁。
2. 滤纸桥及醋酸纤维薄膜要放置平整，保证电场均匀。
3. 严格控制好电流、电压和电泳时间。电流过 大会导致薄膜上水分蒸发过多，严重时使
图谱短而不清晰；电流过低会使样品扩散，也不能得到良好的图 谱。
七、临床意义
1. 肝硬化：清蛋白降低，γ-球蛋白极度升高；
2. 肝癌患者：清蛋白与球蛋白间多出一条甲胎蛋白（AFP）带；
3. 急慢性肾炎、肾病综合症：清蛋白降低，a
1
、a
2
和β-球蛋白升高；
4. 多发性骨髓瘤：清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β和γ- 球蛋白区带之间出现“M”带。
七、复习思考及作业题
思考题：
1. 电泳时，点样端应置于电场的正极端还是负极端？为什么？
2. 引起电泳图谱不整齐、不清晰的原因有哪些？
3. 用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点。
33